Desenvolvimento de espécies de Leishmania fluorescentes e caracterização da susceptibilidade de L. amazonensis GFP como modelo para testes quimioterápicos

• Autor(a) principal: Rocha, Marcele Neves
• Data de Publicação: 2009
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA)
• Texto Completo: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/34512
• topic: Leishmaniose; Imunofluorescência; Transfecção; Fluorometria

As Leishmanioses estão entre as doenças tropicais mais importantes classificadas pela Organização Mundial de Saúde como doenças negligenciadas. Seu controle é baseado no tratamento de casos humanos, borrifação com inseticidas e eliminação dos reservatórios quando possível. Entretanto, a quimioterapia das Leishmanioses apresenta algumas dificuldades tais como: toxicidade dos medicamentos disponíveis, via de administração e resistência natural de algumas cepas. O método de teste de drogas tradicional in vitro apresenta limitações por ser laborioso e sujeito a variações individuais do observador. Devido a estes obstáculos a procura de novas drogas e desenvolvimento de métodos faz-se necessária . Por isso é importante o estabelecimento de um método semi-automatizado para teste de drogas em Leishmania. Para que isto seja alcançado utilizou-se de técnicas de biologia molecular como a inserção de um fenótipo no protozoário permitindo sua detecção em um aparelho. Neste trabalho, produzimos cepas de Leishmania expressando a proteína verde fluorescente ( green fluorescent protein - GFP). Essa proteína foi transfectada nas espécies brasileiras de maior importância médica: L. chagasi, L. braziliensis, L. amazonensis e L guyanensis. Para confirmar a tranfecção, os parasitos selvagens (WT) e transformados (GFPs)foram analisados pela Citometria de Fluxo (FACS) e Microscopia Laser Confocal (LCM).Para avaliar se a transfecção teve algum impacto na viabilidade celular de L. amazonensis foram realizados alguns ensaios biológicos como a comparação da curva de crescimento e infectividade em macrófagos entre as cepas selvagem e GFP. Posteriormente foi verificada a susceptibilidade à drogas. L. amazonensis foram expostas aos fármacos tradicionais e moléculas teste e os valores de IC50 determinados. Não foram observadas diferenças na susceptibilidade entre as cepas tanto na presença dos fármacos tradicionais (Anfotericina B e Glucantime), como de moléculas teste (derivadas do propranolol). Baseado nos valores de IC50 obtidos com o teste tradicional a transformação da cepa GFP de L. amazonensis não alterou suas características biológicas nem de susceptilibidade aos agentes leishmanicidas tradicionais e moléculas teste. Algumas moléculas derivadas do propranolol mostraram ser promissoras na atividade leishmanicida. Estes resultados dão suporte à utilização da cepa GFP nos testes semi-automatizados utilizando o fluorímetro. Isso possibilitará o teste de um número maior de fármacos/moléculas aumentando a eficiência do método quimioterápico atual.