Geração e caracterização de linhagens de células-tronco mesenquimais de camundongo geneticamente modificadas para expressão ectópica de hIGF-1 ou hG-CSF

• Autor(a) principal: Gonçalves, Gabrielle Viana Martins Gonçalves
• Data de Publicação: 2015
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA)
• Texto Completo: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/12758
• topic: Pesquisa com Células-Tronco; Fator de Crescimento semelhante a insulina I; Células Mesenquimais Estromais; Transplante de Células-Tronco Mesenquimais; Stem Cell Research,; Insulin-Like Growth Factor I; Granulocyte-colony stimulating factor; Mesenchymal Stromal Cells; Mice; Mesenchymal Stem Cell Transplantation

As células-tronco mesenquimais (CTM) constituem uma ferramenta promissora para o campo de terapia celular. Além de seu potencial de diferenciação em diferentes tipos celulares, as CTM apresentam a habilidade de secretar moléculas bioativas e, assim, exercer múltiplos efeitos biológicos, tais como indução da regeneração de tecidos lesionados, redução de fibrose e modulação do sistema imune. A superexpressão dos fatores de crescimento G-CSF e IGF-1, conhecidos por seus efeitos sobre os processos de imunomodulação, sobrevivência celular e reparo tecidual, pode ampliar as ações terapêuticas das CTM. O objetivo deste trabalho consiste em gerar e caracterizar linhagens de CTM de camundongo superexpressando hGCSF ou hIGF-1. Um sistema lentiviral de segunda geração foi utilizado para modificação de CTM para expressão ectópica dos genes de interesse. As sequências codificantes de hG-CSF e hIGF-1 foram amplificadas por PCR e subclonadas em um vetor lentiviral de transferência, contendo um promotor constitutivo. As partículas lentivirais foram produzidas a partir da cotransfecção de células da linhagem HEK293FT com os vetores constituintes do sistema lentiviral. Em seguida, as CTM obtidas da medula óssea de camundongos transgênicos para proteína fluorescente verde (GFP) foram transduzidas com partículas lentivirais infectantes contendo hG-CSF ou hIGF-1. A expressão gênica de hG-CSF ou hIGF-1 pelas linhagens geradas foi quantificada por qRTPCR, e a produção da proteína por ELISA. As linhagens foram caracterizadas por imunofenotipagem e avaliadas quanto ao seu potencial de diferenciação celular. Foram geradas duas linhagens de CTM superexpressando hG-CSF e três linhagens superexpressando hIGF-1. Todas demonstraram por qRTPCR, estar efetivamente expressando os genes de interesse. Foi possível detectar e quantificar a síntese proteica de G-CSF e IGF-1. Todas as linhagens geradas foram capazes de se diferenciar em osteócitos, condrócitos e adipócitos, demonstrando a manutenção de seu fenótipo estromal. Neste contexto, este trabalho resultou em ferramentas funcionais para a avaliação dos efeitos terapêuticos de IGF-1 e G-CSF combinados à CTM, em modelos de lesões animais, em comparação com CTM não-modificadas geneticamente. Além disso, estas ferramentas poderão ser empregadas em estudos de pesquisa básica, para melhor compreensão dos efeitos de hIGF-1 e hG-CSF sobre a biologia das CTM.