Aplicação de Técnicas Moleculares para Avaliação da Carga Parasitária de Amostras de Insetos Triatomíneos Infectados por Trypanosoma cruzi
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Data de Publicação: | 2016 |
Tipo de documento: | Dissertação |
Idioma: | por |
Título da fonte: | Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA) |
Texto Completo: | https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/18174 |
Resumo: | A doença de Chagas constitui a quarta mais importante doença tropical, suplantada somente pela malária, tuberculose e esquistossomose. A análise por microscopia é o método clássico para descrição de infecção natural de triatomíneos por Trypanosoma cruzi e apresenta algumas limitações como baixa sensibilidade e reprodutibilidade, dificuldade de exame nos diferentes estágios evolutivos dos vetores, necessidade da análise em insetos frescos, além de ser um procedimento extremamente laborioso. Nesse contexto, a utilização da PCR em Tempo real (qPCR) para o diagnóstico de T. cruzi apresenta várias vantagens, como maior sensibilidade, rapidez e reprodutibilidade, possibilitando investigar o desenvolvimento do parasito no vetor. Neste trabalho, foi desenvolvido um ensaio multiplex de qPCR pelo sistema TaqMan com alvos para o gene correspondente à região 12S do RNA ribossomal de triatomíneos e para o DNA nuclear satélite de T. cruzi, capaz de estimar a carga parasitária em amostras de insetos positivas para infecção por T. cruzi. Além disso, padronizamos uma qPCR com transcrição reversa (RT-qPCR), com alvo para o gene T. cruzi GAPDH, capaz de quantificar parasitos viáveis em amostras de triatomíneos. A reação de qPCR multiplex apresentou uma detecção linear para T. cruzi na faixa de 105 a 0,5 equivalentes de parasitos e para triatomíneo na faixa de 3 a 1,5 x 10-4 equivalentes de triatomíneo. Além disso, foi possível determinar um Limite de Detecção em 0,41 eq. Parasitos. Para validação clínica da PCR quantitativa, 13 amostras de triatomíneos coletados em campo, positivas para infecção por T. cruzi, foram quantificadas e apresentaram cargas variadas, cuja mediana foi de 105 eq. parasito/eq. triatomíneo Posteriormente, para acompanhar o desenvolvimento do T. cruzi (Dm28c) em Rhodnius prolixus, ao longo de todo o trato digestivo e das suas diferentes porções, RNA e DNA total foram extraídos de insetos em diferentes períodos após a alimentação com sangue contendo T. cruzi. Foi possível observar que, a partir de 9 dias pós-alimentação dos insetos, ocorre uma diminuição da quantidade de parasitas viáveis (detectados por RNAm) em todo o trato digestivo do vetor, que não é acompanhada pela diminuição da quantidade de parasitos totais (detectados por DNA). Sendo que, avaliando separadamente o conteúdo intestinal, esta diminuição ocorre principalmente na porção anterior do intestino médio do inseto. Em paralelo, foi observado através de uma RT-qPCR com alvo no gene TcS5, altamente expresso nas formas tripomastigotas, detecção destas formas apenas na quarta semana após alimentação. Os ensaios de qPCR e RT-qPCR desenvolvidos neste estudo contribuirão para para determinar a taxa de infecção de triatomíneos silvestres, além de auxiliar em estudos sobre competência vetorial de triatomíneos e a incidência da doença de Chagas |
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Araujo, Paula FinamoreBruno, Rafaela VieiraGonzalez, Marcelo SalabertRoque, André Luiz RodriguesGomes, Suzete Araujo OliveiraWaghabi, Mariana CaldasWaniek, Peter JosefMoreira, Otacílio da CruzBrito, Constança Felícia De Paoli de Carvalho2017-03-27T14:52:30Z2017-03-27T14:52:30Z2016ARAUJO, P. F Aplicação de Técnicas Moleculares para Avaliação da Carga Parasitária de Amostras de Insetos Triatomíneos Infectados por Trypanosoma Cruzi. 2016. 77f. Dissertação (Mestrado em Biologia Celular e Molecular) - Fundação Oswaldo Cruz, Instituto Oswaldo Cruz, Rio de janeiro, RJ, 2016https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/18174A doença de Chagas constitui a quarta mais importante doença tropical, suplantada somente pela malária, tuberculose e esquistossomose. A análise por microscopia é o método clássico para descrição de infecção natural de triatomíneos por Trypanosoma cruzi e apresenta algumas limitações como baixa sensibilidade e reprodutibilidade, dificuldade de exame nos diferentes estágios evolutivos dos vetores, necessidade da análise em insetos frescos, além de ser um procedimento extremamente laborioso. Nesse contexto, a utilização da PCR em Tempo real (qPCR) para o diagnóstico de T. cruzi apresenta várias vantagens, como maior sensibilidade, rapidez e reprodutibilidade, possibilitando investigar o desenvolvimento do parasito no vetor. Neste trabalho, foi desenvolvido um ensaio multiplex de qPCR pelo sistema TaqMan com alvos para o gene correspondente à região 12S do RNA ribossomal de triatomíneos e para o DNA nuclear satélite de T. cruzi, capaz de estimar a carga parasitária em amostras de insetos positivas para infecção por T. cruzi. 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Foi possível observar que, a partir de 9 dias pós-alimentação dos insetos, ocorre uma diminuição da quantidade de parasitas viáveis (detectados por RNAm) em todo o trato digestivo do vetor, que não é acompanhada pela diminuição da quantidade de parasitos totais (detectados por DNA). Sendo que, avaliando separadamente o conteúdo intestinal, esta diminuição ocorre principalmente na porção anterior do intestino médio do inseto. Em paralelo, foi observado através de uma RT-qPCR com alvo no gene TcS5, altamente expresso nas formas tripomastigotas, detecção destas formas apenas na quarta semana após alimentação. Os ensaios de qPCR e RT-qPCR desenvolvidos neste estudo contribuirão para para determinar a taxa de infecção de triatomíneos silvestres, além de auxiliar em estudos sobre competência vetorial de triatomíneos e a incidência da doença de ChagasChagas disease constitutes the fourth most important tropical disease, supplanted only by malaria, tuberculosis, and schistosomiasis. Microscopical examination is a classic method to describe the natural infection of triatomines by Trypanosoma cruzi, but it presents some limitations. Therefore, the development of molecular assays to quantify with high sensitivity and precision the parasite load in the triatomines is important to further study the vectorial competence of these insects. In this context, this study aims to develop a quantitative Real Time PCR (qPCR) assay to monitor the parasite load in triatomine samples, which is capable to detect and quantify absolute levels of T. cruzi in triatomine samples, differentiating total parasites from viable parasites by DNA and mRNA detection with high sensitivity, specificity and reproducibility, in order to investigate the development of distinct strains of T. cruzi in insect vectors. In this work, we developed a qPCR TaqMan multiplex assay targeting the T. cruzi nuclear satellite DNA and the triatomines 12S rRNA gene, wich is capable to detect and quantify distinct strains of the parasite and species of triatomines. Also, to quantify only viable parasites, a RT-qPCR was developed, targeting the T. cruzi GAPDH and triatomines 12S rRNA genes. Our multiplex qPCR reaction presented a linearity ranging from 105 to 0.5 parasite equivalents, for the T. cruzi target, and from 3 to 0.00015 triatomine equivalents, for the vector insect target. It was also possible to determine that qPCR Limit of Detection (LOD) was 0,41 parasite equivalents To validate the assay, 13 samples from field triatomines, positive for T. cruzi infection, were evaluated by qPCR, with variations in parasite load. Furthermore, to follow T. cruzi (Dm28c) development in Rhodnius prolixus total digestive tract and its different portions, total DNA and RNA were extracted from insect samples under increasing periods after feeding with blood containing T. cruzi. Nine days after feeding, it was possible to observe a time-dependent decreasing on the viable parasite quantity during the time course of the experiment, in which this decreasing occurs mainly in the anterior midgut portion. At the same time, was also observed in a RT-qPCR targeting TcS5 gene, highly expressed in trypomastigotes forms, besides the development of trypomastigotes forms inside the insect vector four weeks after feeding. The qPCR and RT-qPCR assays developed in this study are suitable to determine the infection rate of sylvatic triatomines and they can contribute to understand the vectorial competence of triatomines as well as the incidence of Chagas diseaseFundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, BrasilporAplicação de Técnicas Moleculares para Avaliação da Carga Parasitária de Amostras de Insetos Triatomíneos Infectados por Trypanosoma cruziinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesis2016-07-11Pós-Graduação em Biologia Celular e MolecularFundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo CruzRio de Janeiro/RJPrograma Pós-Graduação em Biologia Celular e MolecularDoença de ChagasRhodniusReação em Cadeia da Polimerase em Tempo RealTrypanosoma cruziinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA)instname:Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ)instacron:FIOCRUZLICENSElicense.txttext/plain1748https://www.arca.fiocruz.br/bitstream/icict/18174/1/license.txt8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33MD51ORIGINALpaula_araujo_ioc_mest_2016.pdfapplication/pdf2720607https://www.arca.fiocruz.br/bitstream/icict/18174/2/paula_araujo_ioc_mest_2016.pdf7abb2dae0a34225ca16de0464ec14bb6MD52TEXTpaula_araujo_ioc_mest_2016.pdf.txtpaula_araujo_ioc_mest_2016.pdf.txtExtracted texttext/plain163000https://www.arca.fiocruz.br/bitstream/icict/18174/3/paula_araujo_ioc_mest_2016.pdf.txt05de742a047b1390c3b53256fda6cc27MD53icict/181742018-08-15 02:32:24.878oai:www.arca.fiocruz.br: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Repositório InstitucionalPUBhttps://www.arca.fiocruz.br/oai/requestrepositorio.arca@fiocruz.bropendoar:21352018-08-15T05:32:24Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA) - Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ)false |
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