Efeitos do Heme e propriedades terapêuticas da hidroxiureia no tratamento da anemia falciforme
Autor(a) principal: | |
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Data de Publicação: | 2018 |
Tipo de documento: | Tese |
Idioma: | por |
Título da fonte: | Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA) |
Texto Completo: | https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/32383 |
Resumo: | A fisiopatologia da anemia falciforme (AF) é marcada por crises hemolíticas e vasoclusivas intermitentes com aumento da condição redox no microambiente vascular que favorece a cronicidade inflamatória. OBJETIVOS: avaliar a associação do heme com marcadores clínico-laboratoriais em pacientes com AF; o papel de hemácias falciformes íntegras e lisadas na expressão gênica do inflamassoma NLRP3, e se o tratamento de pacientes com hidroxiureia (HU) interfere nesta expressão e na liberação de IL-1β e leucotrieno B4 (LTB4); e investigar as propriedades antioxidantes da HU. MÉTODOS: o heme plasmático de pacientes com AF (n = 80) foi dosado por ELISA, os marcadores laboratoriais foram determinados por métodos automatizados,e as análises genéticas por polimorfismo de comprimento de fragmentos de DNA (RFLP).O histórico clínico dos pacientes foi obtido através de prontuários. Os ensaios de expressão gênica de componentes do inflamassoma NLRP3 (NRLP3, IL1B, CASP1 e IL18) por RT-qPCR foram realizados em células mononucleares de sangue periférico humano (PBMC) de voluntários sadios desafiados com hemácias falciformes íntegras e lisadas (n = 8), e hemácias normais (n = 10); e em leucócitos totais de pacientes com AF tratados (n = 13) ou não tratados com hidroxiureia (HU) (n = 15) e voluntários sadios (n = 20). As determinações de IL-1β e LTB4 foram realizadas por ELISA. A atividade antioxidante foi avaliada por ensaios de varredura usando o radical 2,2-difenil-1- hicrilhidrazila (DPPH). A expressão de superóxido dismutase 1 (SOD1), glutationa peroxidase (GPx), glutationa S-redutase (GSR) e heme oxigenase-1 (HMOX1) foi realizada por RT-qPCR em human umbilical vein endotelial cells (HUVEC) e PBMC. Análises de microarranjo foram realizadas em HUVEC tratadas com HU. RESULTADOS: o aumento no heme livre esteve associado ao aumento de hemoglobina S (HbS),contagem de monócitos, marcadores hepáticos,triglicérides e lipoproteína de densidade muito baixa (VLDL-C); e a diminuição dos níveis de hemoglobina fetal (HbF) e lipoproteína de alta densidade (HDL-C). O genótipo BEN/BEN esteve associado a níveis mais elevados de HbF que os CAR/CAR. A liberação de heme livre não apresentou associação com os haplótipos, mas foi associada ao histórico clínico de AVC. As hemácias falciformes íntegras e lisadas (SS-RBC) induziram a expressão de componentes do inflamassoma NLRP3 e a secreção de IL-1β e LTB4. SS-RBC íntegras induziram expressão de IL1B com secreção de IL-1β e LTB4, em comparação com SS-RBC lisadas ou hemácias de voluntários sadios (AA-RBC). A diminuição significativa na expressão de NLRP3 e secreção de LTB4 foram observadas em pacientes tratados com HU. A HU apresentou atividade antioxidante em concentrações equivalentes à encontrada no plasma de pacientes tratados com a droga (~200 μM). Os tratamentos com HU ou HU+hemina não induziram toxicidade em PBMC e HUVEC. O tratamento HU+hemina estimulou a produção de nitrato/nitrito em PBMC e HUVEC. A HU aumentou a expressão de SOD1 e GPx em PBMC e HUVEC. O aumento na expressão de GSR foi observado em PBMC e HUVEC tratadas com HU+hemina. O tratamento com HU (ou em combinação com a hemina) não interferiu na expressão de HMOX1 em PBMC quanto em HUVEC. A HU induziu a expressão de SOD2, GSR, GST1 (glutationa S-transferase-1), GSTM2 (glutationa S-transferase mu 2), MGST1 (glutationa S-transferase 1), CBR1 (carbonil redutase 1), proteinas quinases phosphatidylinositol 3-phosphato C (PRKCB, PRKCZ, PIK3C2B) e sequestossomo-1 (p62/SQSTM1). Em contraste, foi observada a diminuição na expressão do fator transcricional BACH1. Upstream analyses demonstraram predição de ativação de Jun, miR-155 e mir-141-3p. CONCLUSÕES:a liberação excessiva de heme a partir de eventos hemolíticos recorrentes pode contribuir substancialmente para a gravidade clínica da AF. Hemácias íntegras e lisadas podem atuar como DAMPs induzindo diferentemente a expressão de componentes do inflamassoma e a produção de IL-1β e LTB4, contribuindo para o estabelecimento da inflamação. O tratamento com HU parece diminuir a inflamação por vias dependentes de NLRP3 e LTB4. A HU apresenta propriedades antioxidantes diretas eliminando radicais livres além de induzir o sistema enzimático de resposta antioxidante via Nrf2 sob regulação do sequestossomo-1. Esses achados podem auxiliar no desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas que possam ser utilizadas em conjunto com a indução de HbF visando minimizar a cronicidade inflamatória da AF. |
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Santana, Sânzio SilvaPitanga, Thassila NogueiraCrusoé, Edvan de QueirozPrates, Deboraci BritoMenezes, Juliana Perrone Bezerra deCunha, Antonio Ricardo KhouriGonçalves, Marilda de SouzaGonçalves, Marilda de Souza2019-04-04T17:51:02Z2019-04-04T17:51:02Z2018SANTANA, Sânzio Silva. Efeitos do Heme e propriedades terapêuticas da hidroxiureia no tratamento da anemia falciforme. 2018. 196 f. Tese (Doutorado em Patologia Humana) – Instituto Gonçalo Moniz, Fundação Oswaldo Cruz; Universidade Federal da Bahia, Salvador, 2018.https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/32383A fisiopatologia da anemia falciforme (AF) é marcada por crises hemolíticas e vasoclusivas intermitentes com aumento da condição redox no microambiente vascular que favorece a cronicidade inflamatória. OBJETIVOS: avaliar a associação do heme com marcadores clínico-laboratoriais em pacientes com AF; o papel de hemácias falciformes íntegras e lisadas na expressão gênica do inflamassoma NLRP3, e se o tratamento de pacientes com hidroxiureia (HU) interfere nesta expressão e na liberação de IL-1β e leucotrieno B4 (LTB4); e investigar as propriedades antioxidantes da HU. MÉTODOS: o heme plasmático de pacientes com AF (n = 80) foi dosado por ELISA, os marcadores laboratoriais foram determinados por métodos automatizados,e as análises genéticas por polimorfismo de comprimento de fragmentos de DNA (RFLP).O histórico clínico dos pacientes foi obtido através de prontuários. Os ensaios de expressão gênica de componentes do inflamassoma NLRP3 (NRLP3, IL1B, CASP1 e IL18) por RT-qPCR foram realizados em células mononucleares de sangue periférico humano (PBMC) de voluntários sadios desafiados com hemácias falciformes íntegras e lisadas (n = 8), e hemácias normais (n = 10); e em leucócitos totais de pacientes com AF tratados (n = 13) ou não tratados com hidroxiureia (HU) (n = 15) e voluntários sadios (n = 20). As determinações de IL-1β e LTB4 foram realizadas por ELISA. A atividade antioxidante foi avaliada por ensaios de varredura usando o radical 2,2-difenil-1- hicrilhidrazila (DPPH). A expressão de superóxido dismutase 1 (SOD1), glutationa peroxidase (GPx), glutationa S-redutase (GSR) e heme oxigenase-1 (HMOX1) foi realizada por RT-qPCR em human umbilical vein endotelial cells (HUVEC) e PBMC. Análises de microarranjo foram realizadas em HUVEC tratadas com HU. RESULTADOS: o aumento no heme livre esteve associado ao aumento de hemoglobina S (HbS),contagem de monócitos, marcadores hepáticos,triglicérides e lipoproteína de densidade muito baixa (VLDL-C); e a diminuição dos níveis de hemoglobina fetal (HbF) e lipoproteína de alta densidade (HDL-C). O genótipo BEN/BEN esteve associado a níveis mais elevados de HbF que os CAR/CAR. A liberação de heme livre não apresentou associação com os haplótipos, mas foi associada ao histórico clínico de AVC. As hemácias falciformes íntegras e lisadas (SS-RBC) induziram a expressão de componentes do inflamassoma NLRP3 e a secreção de IL-1β e LTB4. SS-RBC íntegras induziram expressão de IL1B com secreção de IL-1β e LTB4, em comparação com SS-RBC lisadas ou hemácias de voluntários sadios (AA-RBC). A diminuição significativa na expressão de NLRP3 e secreção de LTB4 foram observadas em pacientes tratados com HU. A HU apresentou atividade antioxidante em concentrações equivalentes à encontrada no plasma de pacientes tratados com a droga (~200 μM). Os tratamentos com HU ou HU+hemina não induziram toxicidade em PBMC e HUVEC. O tratamento HU+hemina estimulou a produção de nitrato/nitrito em PBMC e HUVEC. A HU aumentou a expressão de SOD1 e GPx em PBMC e HUVEC. O aumento na expressão de GSR foi observado em PBMC e HUVEC tratadas com HU+hemina. O tratamento com HU (ou em combinação com a hemina) não interferiu na expressão de HMOX1 em PBMC quanto em HUVEC. A HU induziu a expressão de SOD2, GSR, GST1 (glutationa S-transferase-1), GSTM2 (glutationa S-transferase mu 2), MGST1 (glutationa S-transferase 1), CBR1 (carbonil redutase 1), proteinas quinases phosphatidylinositol 3-phosphato C (PRKCB, PRKCZ, PIK3C2B) e sequestossomo-1 (p62/SQSTM1). Em contraste, foi observada a diminuição na expressão do fator transcricional BACH1. Upstream analyses demonstraram predição de ativação de Jun, miR-155 e mir-141-3p. CONCLUSÕES:a liberação excessiva de heme a partir de eventos hemolíticos recorrentes pode contribuir substancialmente para a gravidade clínica da AF. Hemácias íntegras e lisadas podem atuar como DAMPs induzindo diferentemente a expressão de componentes do inflamassoma e a produção de IL-1β e LTB4, contribuindo para o estabelecimento da inflamação. O tratamento com HU parece diminuir a inflamação por vias dependentes de NLRP3 e LTB4. A HU apresenta propriedades antioxidantes diretas eliminando radicais livres além de induzir o sistema enzimático de resposta antioxidante via Nrf2 sob regulação do sequestossomo-1. Esses achados podem auxiliar no desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas que possam ser utilizadas em conjunto com a indução de HbF visando minimizar a cronicidade inflamatória da AF.INTRODUCTION: the pathophysiology of sickle cell anemia (SCA) is marked by intermittent hemolytic and vasoconstrictive seizures with increased redox status in the vascular microenvironment that favors inflammatory chronicity. OBJECTIVES: to evaluate the association of heme with clinical-laboratory markers in patients with SCA; the role of intact and lysed erythrocytes in the gene expression of NLRP3 inflammation, and whether the treatment of patients with hydroxyurea (HU) interferes with this expression and the release of IL-1β and leukotriene B4 (LTB4); and investigate the antioxidant properties of HU. METHODS: plasma heme of patients with SCA (n = 80) was dosed by ELISA, laboratory markers were determined by automated methods, and genetic analyzes by DNA fragment length polymorphism (RFLP). The clinical history of the patients was obtained through medical records. The gene expression assays of NLRP3 (NRLP3, IL1B, CASP1 and IL18) components of RT-qPCR were performed on human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of healthy volunteers challenged with whole and lysed sickle cells (n = 8), and normal erythrocytes (n = 10); and total leukocytes from treated (n = 13) or not treated with HU (n = 15) and and healthy volunteers (n = 20). The determinations of IL-1β and LTB4 were performed by ELISA. The antioxidant activity was assessed by sweep tests using the 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radical (DPPH). Expression of superoxide dismutase 1 (SOD1), glutathione peroxidase (GPx), glutathione Sreductase (GSR) and heme oxygenase-1 (HMOX1) was performed by RT-qPCR in human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) and PBMC. Microarray analyzes were performed on HUVEC treated with HU. RESULTS: increased free heme was associated with increased hemoglobin S (HbS), monocyte count, hepatic markers, triglycerides and very low density lipoprotein (VLDL-C); and decreased levels of fetal hemoglobin (HbF) and high-density lipoprotein (HDL-C). The BEN/BEN genotype was associated with higher levels of HbF than the CAR/CAR. The release of free heme was not associated with haplotypes, but was associated with the clinical history of stroke. Intact and lysed red blood cells (SS-RBC) induced the expression of NLRP3 inflammation components and secretion of IL-1β and LTB4. SS-RBC induced IL1B expression with secretion of IL-1β and LTB4, compared to lysed SS-RBC or erythrocytes of healthy volunteers (AA-RBC). Significant decrease in NLRP3 expression and LTB4 secretion were observed in patients treated with HU. HU presented antioxidant activity at concentrations equivalent to that found in the plasma of patients treated with the drug (~200 μM). Treatments with HU or HU+hemin did not induce toxicity in PBMC and HUVEC. The HU+hemin treatment stimulated nitrate/nitrite production in PBMC and HUVEC. HU increased expression of SOD1 and GPx in PBMC and HUVEC. The increase in GSR expression was observed in PBMC and HUVEC treated with HU+hemin. Treatment with HU (or in combination with hemin) did not interfere in the expression of HMOX1 in PBMC as in HUVEC. HU induced expression of SOD2, GSR, GST1 (glutathione S-transferase-1), GSTM2 (glutathione S-transferase mu 2), MGST1 (glutathione S-transferase 1), CBR1 (carbonyl reductase 1), protein kinases phosphatidylinositol 3 -phosphate C (PRKCB, PRKCZ, PIK3C2B) and sequestosome-1 (p62/SQSTM1). In contrast, the decrease in transcriptional factor BACH1 expression was observed. Upstream analyzes demonstrated prediction of activation of Jun, miR-155 and mir-141-3p. CONCLUSIONS: excessive heme release from recurrent hemolytic events may contribute substantially to the clinical severity of SCA. Whole and lysed blood cells can act as DAMPs by inducing the expression of inflammatory components and the production of IL-1β and LTB4, contributing to the establishment of inflammation. Treatment with HU appears to decrease inflammation by NLRP3 and LTB4 dependent pathways. HU has direct antioxidant properties by eliminating free radicals and inducing the enzymatic system of antioxidant response via Nrf2 under sequestosome-1 regulation. These findings may aid in the development of new therapeutic strategies that can be used in conjunction with the induction of HbF in order to minimize the inflammatory chronicity of SCA.CAPES, FAPESB, CNPq e IGM-FIOCRUZ-BA.2023-02-01Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / Universidade Federal da Bahia. Faculdade de Medicina. Salvador, BA, Brasil.porInstituto Gonçalo MonizAnemia falciformeHidroxiureiaEstresse oxidativoSickle cell diseaseHydroxyureaOxidative streeEfeitos do Heme e propriedades terapêuticas da hidroxiureia no tratamento da anemia falciformeinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesis2018-09-13Coordenação de EnsinoUniversidade Federal da Bahia. Faculdade de Medicina.Salvador/BAPós-Graduação em Patologia Humana.info:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA)instname:Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ)instacron:FIOCRUZLICENSElicense.txttext/plain1748https://www.arca.fiocruz.br/bitstream/icict/32383/1/license.txt8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33MD51ORIGINALSanzio Silva Santana Efeitos do Heme ... 2018.pdfSanzio Silva Santana Efeitos do Heme ... 2018.pdfapplication/pdf5817634https://www.arca.fiocruz.br/bitstream/icict/32383/2/Sanzio%20Silva%20Santana%20%20Efeitos%20do%20Heme%20...%202018.pdfcdac96dc33d897bfe69e24a2a5b3277fMD52TEXTSanzio Silva Santana Efeitos do Heme ... 2018.pdf.txtSanzio Silva Santana Efeitos do Heme ... 2018.pdf.txtExtracted texttext/plain377889https://www.arca.fiocruz.br/bitstream/icict/32383/3/Sanzio%20Silva%20Santana%20%20Efeitos%20do%20Heme%20...%202018.pdf.txtbb60218b7d6a82497ea65e5528403b21MD53icict/323832023-04-24 12:15:01.962oai:www.arca.fiocruz.br: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Repositório InstitucionalPUBhttps://www.arca.fiocruz.br/oai/requestrepositorio.arca@fiocruz.bropendoar:21352023-04-24T15:15:01Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA) - Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ)false |
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SANTANA, Sânzio Silva. Efeitos do Heme e propriedades terapêuticas da hidroxiureia no tratamento da anemia falciforme. 2018. 196 f. Tese (Doutorado em Patologia Humana) – Instituto Gonçalo Moniz, Fundação Oswaldo Cruz; Universidade Federal da Bahia, Salvador, 2018. |
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