Optimizing nonviral vectors for gene therapy of the retina
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| Data de Publicação: | 2020 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | eng |
| Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10451/47814 |
Resumo: | Tese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, Faculdade de Ciências, Universidade de Lisboa, 2020 |
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Optimizing nonviral vectors for gene therapy of the retinaTerapia genéticaPolímeroPAEMANLSsPDE6BTeses de mestrado - 2020Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências BiológicasTese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, Faculdade de Ciências, Universidade de Lisboa, 2020A terapia génica tem-se revelado como uma abordagem terapêutica promissora pela manipulação de genes (quer por adição génica, quer por silenciamento ou edição de um gene mutante) para tratar doenças genéticas hereditárias, mas também doenças adquiridas ou infeciosas. Para que a terapia génica seja eficiente tem de compreender também uma forma eficiente de entrega do material genético às células alvo. Esta entrega é efetuada com recurso a dois tipos de vetores distintos: vetores virais e vetores não-virais. O primeiro grupo, que compreende por exemplo os retrovírus ou vírus adeno-associados, está associado a eficiências de transferência e expressão génica mais robustas. Porém, a estes vetores virais também estão associadas maiores toxicidade e imunogenicidade. Por outro lado, os vetores não-virais baseados em polímeros ou lipossomas, apesar de estarem associados a baixas eficiências de transfeção, causam poucos efeitos tóxicos e imunogénicos. Adicionalmente, estes veículos apresentam baixos custos de produção, e têm geralmente maior capacidade para transportar genes de maiores dimensões do que os vetores virais. Devido a todas estas vantagens, e apesar das suas baixas eficiências de transfeção, tem-se verificado um aumento do interesse nos vetores não-virais por parte da comunidade científica. Para que um vetor seja eficiente na entrega de material genético tem de ser capaz de (a) complexar com o DNA terapêutico, mas também ultrapassar diversas barreiras, nomeadamente (b) entrar na célula, (c) escapar ao sistema endo-lisossomal, (d) atingir o núcleo, (e) atravessar a invólucro nuclear e, finalmente, (f) permitir a expressão do DNA terapêutico. Trabalho previamente desenvolvido no nosso grupo mostrou que poliplexos (polímero complexado com DNA) de PDMAEMA [poli(2-dimetilamino(etilmetacrilato)] se acumulam em redor do núcleo em menos de 24 horas após a transfeção. Sendo que as células da retina são pós-mitóticas, há aqui uma dificuldade acrescida em ultrapassar a invólucro nuclear e assim expressar o gene de interesse. Assim, colocamos a hipótese de que se ligarmos nuclear localization signals (NLSs), que são sequências peptídicas que dirigem proteínas para o núcleo, aos poliplexos poderemos aumentar a eficiência de transfeção destes vetores não-virais. Para efetuar esta ligação, é necessário substituir as aminas terciárias que compõem os monómeros que constituem o PDMAEMA por aminas primárias. Nas aminas terciárias, os azotos encontram-se ligados a três carbonos, portanto são maus nucleófilos e, consequentemente, a reação de ligação com os NLSs seria pouco provável. Por outro lado, nas aminas primárias, os azotos encontram-se ligados a três hidrogénios e sendo este tipo de ligação mais fraca, estas aminas são melhores nucleófilos e, portanto, reagirão melhor para se ligarem aos NLSs. Para tal, foram testadas reações com 2 compostos diferentes para substituir algumas das aminas terciárias por aminas primárias: etilenodiamina (EDA) e etanolamina (EA). Os espectros de NMR (1H nuclear magnetic resonance) e FTIR (Fourier-transformed infrared spectroscopy) dos produtos finais de ambas as reações revelaram-se iguais ao espectro característico do polímero PDMAEMA e, portanto, estas reações não foram eficientes. Consequentemente, sintetizamos um novo polímero, poli(2-aminoetilmetacrilato) (PAEMA), cujos monómeros que o constituem apenas diferem na presença de aminas primárias relativamente aos monómeros que constituem o PDMAEMA que, por sua vez, contêm aminas terciárias. Os espectros de NMR e FTIR deste novo polímero, PAEMA, apenas revelam a presença de aminas primárias e assim concluímos que a síntese por polimerização RAFT (reversible addition-fragmentation chain transfer) foi eficiente. Para testar se a adição de NLSs melhora a capacidade de transferência de genes do PAEMA, foram testados cinco diferentes NLSs. Em primeiro lugar foram utilizadas duas sequências derivadas do terminal carboxílico das proteínas IGFBP-3 e IGFBP-5, o NLS3 e o NLS5, respetivamente. Em seguida, foram geradas 2 sequências com o mesmo conteúdo de aminoácidos das duas sequências anteriores, mas com um novo alinhamento. Finalmente, criámos uma sequência de aminoácidos aleatória com a particularidade de não conter argininas e lisinas, que são os aminoácidos usualmente associados à função dos NLSs, à qual chamamos R-NLS. Para testar os nossos vetores não-virais otimizados, focamo-nos na Retinitis Pigmentosa (RP). A RP é uma doença caracterizada pela degeneração dos fotorrecetores, principalmente dos bastonetes, causando cegueira noturna e em casos mais avançados, cegueira total. Sabe-se que o gene PDE6B que codifica para a subunidade β do complexo PDE6 está mutado numa das formas desta doença. Assim, construímos um plasmídeo que codifica simultaneamente a sequência não mutada deste gene e a sequência do gene da GFP (Green Fluorescent Protein). Entre estes dois genes colocámos uma sequência designada P2A, que codifica para uma sequência que se auto-cliva após a tradução originando duas proteínas isoladas, o que permite monitorizar a expressão de PDE6β sem afetar a sua função como aconteceria por fusão com a GFP. Após a sua construção, o plasmídeo foi testado quanto à eficiência de expressão destes dois genes. Os resultados obtidos por imunocitoquímica e por Western blot mostraram que PDE6β e GFP são expressos separadamente, porém, por citometria de fluxo concluímos que a expressão de GFP é significativamente mais baixa quando comparado com células transfetadas com um plasmídeo que apenas codifica para GFP. Numa primeira fase foram sintetizados poliplexos com o plasmídeo que apenas codifica para GFP e com o polímero PAEMA em 4 diferentes rácios N/P (aminas/fosfatos – 7,5:1; 10:1; 16:1 e 20:1). De seguida, a análise destes poliplexos revelou que estes têm um tamanho abaixo de 500 nm, uma carga superficial positiva, o que favorece a entrada nas células e, por fim, uma polidispersividade menor que 0,5, o que significa que estamos perante uma população homogénea relativamente ao tamanho. Adicionalmente, verificámos que estes poliplexos são estáveis e capazes de proteger o DNA terapêutico contra a degradação por fatores externos como DNAses ou poli-aniões, que por sua vez promovem a destabilização dos poliplexos. Estas são características adequadas para um polímero ser usado para terapia génica. Testes in vitro, como citometria de fluxo e microscopia de fluorescência, realizados numa linha celular do epitélio pigmentado da retina (D407) revelaram que quanto maior o rácio N/P maior a eficiência de transfeção; portanto, os rácios mais elevados (16:1 e 20:1) foram selecionados para efetuar a otimização com os NLSs. Adicionalmente, a análise dos resultados de citometria de fluxo indicaram que não existe uma diminuição do número células vivas quando transfetadas com este polímero. Este resultado é encorajador visto que alguns polímeros estão associados a efeitos tóxicos para as células. A análise do número de células GFP positivas por citometria de fluxo mostrou que os poliplexos do rácio 16:1 quando otimizados com o NLS3 revelam um aumento na ordem de 60 % de eficiência de transfeção relativamente ao controlo com poliplexos do mesmo rácio não otimizados. Relativamente aos poliplexos do rácio 20:1, apesar de não serem estatisticamente significativo, existe também uma tendência para um aumento número de células GFP positivas quando comparado com o controlo. Pelo descrito podemos concluir que o polímero PAEMA é capaz de formar poliplexos com as características ideais para terapia génica. Devido à presença de aminas primárias foi possível otimizar os poliplexos através da ligação covalente a NLSs o que, em particular para os poliplexos otimizados com o NLS3 permitiu um aumento significativo n eficiência de transfeção. Conclui-se assim que os vetores não virais otimizados podem ser promissores não só para doenças da retina como também para outros tipos de doenças. Futuramente será importante efetuar testes in vivo no modelo de murganho de Retinitis Pigmentosa.Gene therapy aims to use genetic tools in order to treat both genetic and acquired diseases. To have an efficient gene therapy approach, the vehicle that delivers the therapeutic DNA must be able to cross several barriers, in particular those pertaining to the cell. Amongst the vectors used for gene therapy, nonviral vectors have huge potential; however, optimization is still needed for higher gene transfer efficiency. In our group, we aim to target retinal cells; we have previously shown that entering the nucleus was the main obstacle for nonviral vectors, as retinal cells are post-mitotic. Therefore, we aimed to increase the efficiency of transfection of our nonviral vectors by conjugating nuclear localization signals (NLSs), which are amino acid sequences responsible for directing molecules to the nucleus. To test our approach, we have used a model disease Retinitis Pigmentosa (RP), the most common form of inherited retinal degeneration, in particular, that caused by a mutation in the β subunit of the PDE (phosphodiesterase 6) complex. We firstly generated a plasmid expressing both the gene of the β subunit of PDE and the reporter gene eGFP and complexed it with our polymer PAEMA [poly(2-aminoethyl methacrylate)] previously conjugated with NLSs. We have found that the resulting nonviral vector stably incorporates the plasmid and protects it from degradation. Secondly, we have tested the gene transfer efficiency of these vectors in vitro using a human retinal pigment epithelium (RPE) cell line (D407). PAEMA polyplexes, in particular those containing NLSs, are capable of efficiently transfect RPE cells. Moreover, in the presence of the NLSs, polyplex formulations show adequate characteristics for gene transfer. Overall, these results demonstrate that optimized PAEMA-based nonviral vectors possess increased gene transfer ability and can be further tested in vivo mouse models of retinal degeneration.Silva, GabrielaZilhão, RitaRepositório da Universidade de LisboaSequeira, Raquel Lourenço das Neves2021-05-12T17:42:45Z202020202020-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/47814TID:202606201engmetadata only accessinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:50:58Zoai:repositorio.ul.pt:10451/47814Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:59:47.413428Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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