O papel dos halogénios no desenho de fármacos. O caso da ligação de pequenos ligantes à Transtirretina.
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| Data de Publicação: | 2019 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | por |
| Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10316/87875 |
Resumo: | Dissertação de Mestrado em Química Medicinal apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia |
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O papel dos halogénios no desenho de fármacos. O caso da ligação de pequenos ligantes à Transtirretina.The role of halogens in drug design. The case of ligand-binding by Transthyretin.19F-RMNTranstirretinaAG10DiflunisalÁcido Flufenâmico19F-NMRTransthyretinAG10DiflunisalFlufenamic acidDissertação de Mestrado em Química Medicinal apresentada à Faculdade de Ciências e TecnologiaAbnormal protein folding/unfolding followed by protein aggregation is often associated to disease development. That is the case of human Transthyretin (TTR), a homotetrameric protein found in plasma, cerebrospinal fluid and the humour of the eye, responsible for thyroxine and retinol transport, in association with the retinol-binding protein. TTR is known to undergo conformational changes and form soluble aggregates and insoluble highly stable amyloid fibrils that accumulate extracellularly in the tissues, causing several types of amyloidosis, such as hereditary TTR amyloidosis with polyneuropathy (hATTR-PN), hereditary TTR amyloidosis with cardiomyopathy (hATTR-CM) and age-related TTR amyloidosis (ATTRwt). Currently there are several therapeutic solutions for some of the TTR amyloidoses, but their efficacy is still limited. The need to find new medicines for the treatment of TTR amyloid diseases (ATTR) led to the discovery of several fluorinated compounds, among them AG10, diflunisal and flufenamic acid.Here we present a study on the interactions and affinities between each of the three fluorinated compounds mentioned above and the two binding sites for the endogenous ligand (thyroxine) in wild-type TTR (wt-TTR), using titration experiments followed by 19F-NMR and Isothermal titration calorimetry (ITC). The use of 19F-NMR in studies of interactions of fluorinated ligands with proteins has received great attention due to the high sensitivity of 19F-NMR line width and chemical shift to modifications in exchange regime and chemical environment accompanying ligand binding to a protein. The titration experiments followed by 19F-NMR with diflunisal and AG10 show these ligands are in intermediate to fast exchange regime on the NMR time scale, with each spectrum having only one peak with increased line width but without significant chemical shift perturbation when compared with the free form. These observations show these two compounds do interact with the protein, but these interactions seem to not directly involve the fluorine because no significant differences in chemical shifts are observed. On the other hand, 19F-NMR titration experiments with flufenamic acid show two different exchange regimes with one peak in fast exchange and other in slow exchange. The larger line width of the two peaks, compared to the free compound, indicates that two different conformations of flufenamic acid are detected, one of which having direct fluorine interactions, due to the large chemical shift difference observed, and the other not involving direct fluorine interactions. Knowing there is negative cooperativity in flufenamic acid binding by wt-TTR, previously reported in the literature and confirmed by ITC in this work, and taking in consideration the exchange regimes, the chemical shift changes and the line widths observed for the two signals in the 19F-NMR spectra, it is safe to conclude that binding to each one of the TTR binding sites is being observed. The first visible signal in the tritation, in slow exchange, corresponds to the ligand conformation in the first binding site, in accordance with the large signal line width, the downfield chemical shift change (due to direct interaction involving fluorine) and the high affinity of this binding site (measured by ITC). The second signal to appear in the titration, in fast exchange, corresponds to the ligand conformation in the second binding site, with a much narrower line width than the first signal and no significant chemical shift change from the free form, in agreement with the lower affinity of the ligand for this binding site.O enrolamento/desenrolamento anormal de proteínas seguido pela sua agregação está, geralmente, associado ao desenvolvimento de doenças. É o caso da proteína humana transtirretina (TTR), uma proteína homotetramérica encontrada no plasma, fluido cefalorraquidiano e no humor vítreo e aquoso do olho, responsável pelo transporte de tiroxina e retinol, quando em associação com a proteína transportadora de retinol. A TTR é conhecida por sofrer alterações conformacionais e formar agregados solúveis e fibras amiloides altamente estáveis e insolúveis, que se acumulam extracelularmente nos tecidos, causando vários tipos de amiloidoses, tais como a TTR amiloidose hereditária com polineuropatia, TTR amiloidose hereditária com cardiomiopatia e TTR amiloidose relacionada com a idade. Atualmente, existem várias abordagens terapêuticas para algumas das amiloidoses de TTR (ATTR), sendo, contudo, a sua eficácia limitada. A necessidade de encontrar novos fármacos para doenças amiloides envolvendo a TTR, levou à descoberta de diversos compostos, alguns deles fluorados, tais como AG10, diflunisal e ácido flufenâmico.Neste trabalho apresentamos um estudo sobre as interações e afinidade entre cada um dos três compostos fluorados mencionados acima e os dois locais de ligação na wt-TTR, usando 19F-RMN e Calorimetria de titulação isotérmica (CTI). O uso de 19F-RMN em estudos de interação fármaco-proteína envolvendo flúor tem recebido grande atenção, uma vez que a largura de linha e o desvio químico em 19F-RMN é altamente sensível a mudanças de regime de troca e ambiente químico, que geralmente acompanham o processo de ligação de um pequeno ligante a uma proteína. As experiências de titulação de TTR com AG10 e diflunisal seguidas por 19F-RMN mostraram regimes de troca rápida a intermédia na escala de tempo do RMN e com cada espetro possuindo apenas um sinal correspondente ao único átomo de flúor presente na molécula, sem alterações significativas dos desvios químicos em consequência da ligação. Além disto, os dois compostos mostram interagir com a proteína, devido ao aumento da largura da linha a meia altura, mas as interações não envolvem diretamente o flúor, porque não são observadas diferenças significativas dos desvios químicos. Por outro lado, as experiências de titulação com o ácido flufenâmico, seguidas por 19F-RMN, mostram dois regimes de troca química diferentes: um sinal em troca rápida e o outro em troca lenta. O aumento da largura da linha a meia altura nos dois sinais, comparando com o sinal do composto na forma livre, leva-nos a ponderar que os sinais observáveis nos espetros da titulação correspondem a duas conformações diferentes do ácido flufenâmico quando interage com a wt-TTR, sendo que numa delas há uma interação direta com o flúor, dada a alteração significativa de desvio químico em relação à forma livre. Tendo em conta que existe cooperatividade negativa na ligação do ácido flufenâmico à wt-TTR, reportada na literatura e confirmada neste trabalho por CTI, tendo em conta ainda os regimes de troca química, os desvios químicos e as larguras a meia altura observados para os dois sinais no espetro 19F-RMN, podemos concluir que estamos a observar a interação do composto em cada um dos dois locais de ligação existentes na TTR. O primeiro sinal a ser observado durante a titulação, em regime de troca química lenta, corresponde à conformação adquirida pelo composto no primeiro local de ligação, devido à grande largura do sinal, ao deslocamento do desvio químico para campo baixo (devido à interação direta com o flúor) e à alta afinidade desse local de ligação. O segundo sinal a surgir na titulação, em regime de troca química rápido, corresponde à conformação adquirida pelo composto no segundo local de ligação, sendo que este sinal não é tão largo como o primeiro, não há alteração significativa do desvio químico em relação à forma livre e a afinidade de ligação para este local de ligação é menor.2019-09-25info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesishttp://hdl.handle.net/10316/87875http://hdl.handle.net/10316/87875TID:202309231porCaniceiro, Ana Beatriz Ramosinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2022-11-07T09:52:41Zoai:estudogeral.uc.pt:10316/87875Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:08:42.140196Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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