Understanding the roles of PIWIL3 and TACC3 proteins during bovine oocyte development

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Leitoguinho, Ana Rita Canhoto, 1989-
Data de Publicação: 2012
Outros Autores: Roelen, Bernard
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/7509
Resumo: Tese de mestrado. Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2012
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spelling Understanding the roles of PIWIL3 and TACC3 proteins during bovine oocyte developmentEmbriologiaBovinosBiologia do desenvolvimentoTeses de mestrado - 2012Tese de mestrado. Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2012In order to achieve a healthy embryo, the germline needs to properly develop while protecting its genome against endogenous and exogenous adversities. The PIWI proteins, a subgroup of Argonaute proteins, are involved in the search and silencing mechanism of transposons ‐ genetic transposable elements‐ through a mechanism of complementarity with piRNAs (Piwi‐interacting RNAs). These proteins are germline‐specific and are thought to be also male‐specific in mammals. PIWIL3 (Piwi‐like 3) is part of this family and it is present in the human and bovine genome, while rodents have PIWIL1, PIWIl2 and PIWIL4, but lack a gene for PIWIl3. Recent findings on bovine cells suggested a role for PIWIL3 in the female germline, the oocyte. Here, PIWIL3 protein was detected both in the bovine oocyte and in somatic cells surrounding it, using an antibody directed against the Human PIWIL3 suggesting a role for this protein in protecting the oocyte genome. Besides protecting the genome, the oocyte also needs to enroll meiosis. Transforming acidic coiled‐coil 3 (TACC3) acts in a complex with ch‐TOG and clathrin to ensure mitotic spindle stability and organization. TACC3 is phosphorylated and activated by Aurora‐A kinase and it is responsible for TACC3’s proper placement in the centrosomes. The order of recruitment of these proteins to the spindle is still open for debate, as it is the role of TACC3 during meiosis. Our antibody designed to identify bovine PIWIL3 was in fact recognizing TACC3 and we could therefore study the spatiotemporal localization of TACC3 in the oocyte and during embryo development. When bovine oocytes are matured with MLN8054, an Aurora‐A inhibitor, they exhibit (i) dispersion of TACC3 protein in the cytoplasm (ii) formation of an abnormal meiotic spindle (ii) meiotic arrest in the metaphase I stage and (iii) decreased percentage of blastocyst formation suggesting a role of TACC3 in meiotic spindle assembly, vital for oocyte and early embryo development.Todos os indivíduos que se reproduzem sexualmente combinam a sua informação genética para criar um novo ser e apesar de todas as células possuírem esta informação, apenas as células sexuais são capazes de a transmitir à descendência. É por isso vital proteger estas células de fatores externos ou internos que possam afetar o seu genoma bem como certificar um correto desenvolvimento do oócito com o intuito de formar um embrião saudável. O processo de maturação do oócito envolve o desenvolvimento da célula bem como a criação de estruturas de suporte que o protegem de agressões externas. A Foliculogénese é processo responsável pelo suporte físico do oócito, altamente regulado hormonalmente pelo ovário, onde várias camadas celulares são formadas consecutivamente em volta do oócito, contribuindo para que o resultado final seja uma célula sexual protegida, formando o folículo antral. Concomitantemente, também a própria célula sofre alterações críticas. Durante a maturação nuclear do oócito, ou oogénese, é essencial que este reduza o seu número de cromossomas a metade, formando um gameta haplóide (com metade da informação genética). Após fertilização, este resultará num zigoto diplóide (com o total da informação genética) com informação materna e paterna que diferem não apenas na informação genética mas também em fatores associados que são transmitidos não por via genética, mas por via epigenética. Para além dos rearranjos nucleares acima referidos, também o genoma da célula sexual está sujeito a agressões endógenas, como os transposões, elementos móveis do genoma que se podem inserir em diversas zonas, podendo interferir com a transcrição de genes vitais para a célula. Existem vários mecanismos de defesa celular que silenciam estes elementos, um destes é o RNA de interferência (RNAi) que, com ajuda de proteínas Argonautas, consegue localizar e silenciar RNA mensageiro (mRNA) através de um mecanismo de complementaridade, evitando a sua propagação pelo genoma. Esta família de Argonautas contém o grupo de proteínas PIWI cuja expressão é restrita às células da linha germinal. Recentemente descobriu‐se que estas proteínas PIWI são alvo de um tipo particular de RNAi, os piRNAs (Piwi‐interacting RNAs) cuja principal função é silenciar elementos transponíveis na linha germinal. Tendo como base mutantes PIWI em Drosophila que ativam transposões, o estudo de proteínas PIWI e piRNA tem avançado bastante nos últimos tempos revelando também em C. elegans, Zebrafish e ratinho o papel destas proteínas na formação da linha germinal. No ratinho existem três genes da família PIWI: Miwi (Piwi‐like 1), Mili (Piwi‐like 2) e Miwi2 (Piwi‐like 4) e mutantes destes genes resultam em esterilidade masculina, em contraste com Drosophila e Zebrafish onde ambas as linhas germinais masculina e feminina são afetadas. Até à data não se sabe a função destas proteínas na linha germinal feminina de mamíferos, razão pela qual a descoberta de um quarto gene Piwi‐like (PIWIL3) em mamíferos que não o ratinho suscitou bastante interesse. Recentemente, este gene foi descrito em oócitos de bovinos e a facilidade em obter oócitos de vaca fizeram com que este organismo fosse o escolhido para o estudo desta proteína PIWIL3. Os nossos resultados revelaram primeiro que tudo que o anticorpo e primers construídos anteriormente para a proteína PIWIL3 em vaca estavam mal construídos. Propomos aqui um padrão de expressão proteico diferente do anteriormente documentado. Com o uso de anticorpos anti‐humano dirigidos a PIWIL3, identificou‐se a proteína nas células de suporte que rodeiam o oócito, sugerindo que a expressão desta proteína PIWI em vaca não é específica para a linha germinal. Esta presença de PIWIL3 na linha somática que rodeia o oócito pode ser essencial para a proteção do genoma do oócito, essencial para a correta propagação da informação genética à descendência. Aquando do estudo de PIWIL3, descobriu‐se que o anticorpo estava a reconhecer uma outra proteína em vez de PIWIL3, a TACC3 (Transforming Acidid Coiled‐Coil protein 3), o que fez com que este projeto se começasse a focar no papel desta outra proteína durante o desenvolvimento do oócito. Também uma correta divisão celular é essencial para uma célula sexual e as proteínas TACC (Transforming acidic coiled‐coil proteins) estão de mãos dadas com esta prática. Estas proteínas estão presentes em diferentes organismos e localizam‐se tanto nos microtúbulos que se formam durante o processo de separação dos cromossomas como nos centrossomas, estruturas que se localizam nos dois pólos opostos do fuso mitótico. Em ratinho são conhecidas três proteínas TACC ‐ TACC1, TACC2 e TACC3 ‐ e sabe‐se que TACC3 é essencial para a correta formação do fuso mitótico durante uma mitose. Mutantes TACC3 revelaram um fuso mitótico anormal que, juntamente com cromossomas desalinhados na placa metafásica, originam incorreta segregação cromossómica, resultando em células‐filha com diferente conteúdo cromossómico. O recrutamento de TACC3 para os microtúbulos que formam o fuso é regulado por uma kinase, a Aurora‐A, que é responsável pela fosforilação e ativação desta proteína em diversas espécies como Drosophila, C.elegans, Xenopus e Humanos. Quando esta kinase é inibida, por exemplo pelo composto MLN8054, a mitose falha de forma semelhante aos mutantes de TACC3, contudo alguma células conseguem dividir‐se, ainda que originando células aneuplóides ou tetraplóides. Porém, TACC3 não atua sozinha e recentemente foi descoberto que o faz em conjunto com outras duas proteínas num complexo proteíco denominado TACC3/ch‐TOG/clatrina. TACC3, clatrina e ch‐TOG (Colonic‐hepatic Tumour Overexpressed Gene) atuam como pontes entre microtúbulos e têm como função estabilizar estas fibras. Apesar de se saber que todos os intervenientes do complexo são importantes, a ordem de recrutamento dasdiferentes proteínas ainda é alvo de uma acesa discussão entre defensores que afirmam que clatrina recruta TACC3 e outros que defendem ser TACC3 o primeiro componente do complexo, recrutando clatrina. Apesar de ter sido estudada em oócitos de ratinho, informação sobre a função da proteína TACC3 durante a meiose de mamíferos é quase nula, o que realça a importância deste estudo. Os nossos resultados demonstram que a proteína se encontra rodeando a cromatina do oócito e no fuso meiótico do mesmo durante a meiose, sugerindo um papel semelhante ao documentado no ratinho quanto à manutenção dos microtúbulos do fuso. Quanto à sua função, foi utilizado um inibidor de Aurora‐A, MLN8054, que resultou numa paragem no desenvolvimento do oócito na metafase I, efeito semelhante aos previamente descritos em células humanas. Também o fuso meiótico revelou sérias perturbações quando os oócitos maturam num meio com o inibidor o que, juntamente com a dispersão da proteína TACC3 no citoplasma e a diminuição da percentagem de blastocistos formados, sugere que este inibidor estará a influenciar a expressão ou ativação de TACC3. Apesar de não conseguirmos saber ao certo com este estudo se TACC3 esta de fato inibida, é essencial averiguar o padrão de fosforilação desta proteína para poder estabelecer uma ligação causaefeito entre o inibidor e a fosforilação/correta localização de TACC3. Também nesta tese é proposto um modelo de recrutamento do complexo que se baseia na possibilidade de ser TACC3 o primeiro e talvez principal interveniente. Em suma, os resultados desta tese referentes a TACC3 e a PIWIL3 revelam que ambas aparentam ter uma função durante o desenvolvimento da linha sexual feminina e é considerado de extrema importância estudar ambas. Quanto aos entraves que o projeto PIWIL3 sofreu, apesar de ter afetado parte da investigação da PIWIL3, serviu também para conhecer esta nova proteína, a TACC3, em oócitos. Esta tese propõe um padrão de expressão diferente de PIWIl3 com uma possível função também na linha somática em redor do oócito. Quanto a TACC3 os nossos resultados revelaram que quando a sua ação é inibida, os oócitos não progridem na oogénese e revelam anomalias no fuso. Assim é sugerido que esta proteína tenha um papel crucial no processo de formação e correto alinhamento dos cromossomas na placa metafásica durante o desenvolvimento do oócito de vaca.Rodrigues, Maria Gabriela, 1965-Roelen, BernardRepositório da Universidade de LisboaLeitoguinho, Ana Rita Canhoto, 1989-Roelen, Bernard2013-01-15T18:12:47Z20122012-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/7509enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T15:50:46Zoai:repositorio.ul.pt:10451/7509Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:32:18.305619Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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