Detection of actionable mutations in ctDNA in advanced breast cancer patients

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Dias, Inês Isabel Vendrell Vidal
Data de Publicação: 2019
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/39454
Resumo: Tese de mestrado, Oncobiologia, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2019
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spelling Detection of actionable mutations in ctDNA in advanced breast cancer patientsCancro da mama metastáticoMedicina de precisãoBiópsias líquidasMutações e amplificações alvoTeses de mestrado - 2019Domínio/Área Científica::Ciências MédicasTese de mestrado, Oncobiologia, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2019Background: Breast Cancer (BC) is one of the most important causes of death by cancer in the world. Cancer mortality is directly related to the inability of curing advanced disease. Much has been the effort in the last decades to develop new drugs. Precision oncology aims at delivering the most adequate treatment to each patient according to the specific characteristics of the disease at each time point. Nevertheless, considering tumor heterogeneity, both temporal and spatial, tissue biopsies might be less accurate than new emerging techniques such as circulating cell-free tumor DNA (ctDNA) analysis in blood – liquid biopsy. It is estimated that 80-90% of advanced cancer patients have genetic alterations that could potentially be targeted with a specific drug and some studies suggest that patients treated with these targeted drugs might have better outcomes, although there is controversy. This is a proof-of-concept study. With this study we aimed to determine: 1. If ctDNA can be isolated from plasma samples of patients with metastatic BC; 2. If it is possible to detect specific druggable mutations and amplifications in ctDNA, namely: PIK3CA mutation and amplification, AKT1 mutation, AKT2 amplification, EGFR amplification, FGFR1 amplification; 3. If there is an association between genetic alterations detectable in plasma and tumor biopsies performed at the same time. Methods: This is a single center prospective observational study with sample collection. We included patients with metastatic BC (MBC) de novo or after progression or relapse. We also included stage III BC patients with advanced unresectable disease. Only patients with clinical indication for re-biopsy and who gave consent for biopsy and blood sample collection were included. For each patient, analysis of the tumor and blood sample were performed with a maximum 8-week interval. DNA was extracted from tissue samples and ctDNA was isolated from plasma. Digital droplet PCR (ddPCR) was used to detect amplifications and massive parallel sequencing (MPS) was used for mutations. We extracted germline DNA (gDNA) from leukocytes to screen for mutations in targeted genes, in order to prove a potential somatic origin for the detected mutations. Results: We enrolled 2 patients who had undergone previous lines of treatment and progressed. While patient 001 had MBC (rebiopsy of a lung metastasis), patient 002 had locally advanced, unresectable disease (rebiopsy of the breast). Regarding amplification of the genes tested, we detected an amplification in FGFR1 in patient 001, both in tissue (8.5-fold increase in copy number) and plasma samples (9.7-fold increase in copy number). We also detected a PIK3CA mutation in exon 10 (coding exon 9) in patient 002, which is one of the most frequent mutations in PIK3CA found in BC [c.1633G>A p.(E545K)]. This mutation was detected only in tissue sample and not in ctDNA; this mutation was proven somatic since it was not present in the gDNA. Conclusions: We succeeded to isolate ctDNA from plasma samples for both patients – proven by the finding of the somatic variants. We were able to detect one actionable alteration for each patient: FGFR1 amplification was present in both tissue and ctDNA of patient 001. Regarding patient 002 a mutation in PIK3CA was detected, although only in tumor tissue sample. We did not find a complete concordance between mutations detected in tumor tissue and plasma samples. This might be due to several reasons, either technical or biological.Racional: O cancro da mama é, mundialmente, uma das principais causas de morte por cancro. A mortalidade relaciona-se directamente com a incapacidade de curar a doença avançada. Nas últimas décadas têm-se empreendido importantes esforços no desenvolvimento de novos fármacos. A oncologia de precisão almeja providenciar a terapêutica mais adequada a cada doente de acordo com as características específicas da doença, em cada momento. Contudo considerando a heterogeneidade tumoral, quer temporal quer espacial, as biópsias tecidulares podem ser menos precisas que novas técnicas tal como a análise de DNA tumoral circulante no sangue (ctDNA) – biópsia líquida. Estima-se que 80-90% dos doentes com cancros avançados apresentem alterações genéticas a nível do tumor que poderiam potencialmente ser alvo de terapêutica com fármacos dirigidos. Na verdade, alguns estudos sugerem que os doentes tratados com fármacos dirigidos tenham melhores resultados em termos de saúde, embora seja controverso. Este é um estudo de prova de conceito. Com este estudo procuramos determinar: 1. Se o ctDNA pode ser isolado de amostras plasmáticas de doentes com cancro da mama metastático; 2. Se é possível detectar determinadas mutações e amplificações que possam ser alvo terapêutico no ctDNA. Nomeadamente: mutação e amplificação PIK3CA, mutação AKT1, amplificação AKT2, amplificação EGFR, amplificação FGFR1; 3. Se há associação entre as alterações genéticas detectadas no plasma e em biópsias tecidulares realizadas simultaneamente. Métodos: Este é um estudo observacional prospetivo unicêntrico com colheita de amostras. Incluímos doentes com cancro da mama metastático de novo ou após recidiva ou progressão. Também incluímos doentes com cancro da mama estadio III com doença irressecável. Foram apenas incluídos doentes com indicação clínica para re-biópsia e que consentiram quer a colheita de tecido quer de sangue. Para cada doente a análise tumoral e de plasma foram realizadas com um intervalo máximo de 8 semanas. O DNA foi extraído de amostras de tecido e o ctDNA foi isolado a partir do plasma. Usámos Digital droplet PCR (ddPCR) para detectar amplificações e sequenciação massiva em paralelo (MPS) para mutações. Extraímos DNA germinal (gDNA) de leucócitos e analisámos mutações em genes algo com MPS. Resultados: Foram incluídos 2 doentes que tinham sido submetidos a linhas terapêuticas prévias com progressão. Enquanto o doente 001 tinha neoplasia da mama metastática (biópsia de metástase pulmonar), o doente 002 tinha doença localmente avançada, irressecável (biópsia da mama). O DNA foi isolado das amostras de plasma e quantificado; estava presente DNA em ambas as amostras plasmáticas. Foi extraído DNA de amostras congeladas obtidas por biópsia. Considerando a amplificação dos genes testados, detectámos amplificação no FGFR1 no doente 001, quer no tecido (aumento do número de cópias em 8.5 vezes), quer no plasma (aumento do número de cópias em 9.7 vezes). No doente 002 foi detectada uma mutação no PIK3CA no exão 10 (exão codificante 9), que é a mutação mais frequente do PIK3CA encontrada no cancro da mama [c.1633G>A, p.(E545K)]. Esta mutação foi apenas detectada na amostra tecidular e não no ctDNA; esta mutação não estava presente no DNA germinal isolado a partir de leucócitos, pelo que se comprovou ser somática. Conclusões: Foi possível isolar DNA circulante do plasma de ambos os doentes – facto comprovado pela detecção de variantes somáticas. Foi possível detectar alterações passíveis de ser alvos terapêuticos em ambos os doentes: amplificação do FGFR1 (tecidular e plasmática) no doente 001 e mutação do PIK3CA no doente 002 – embora esta tenha sido apenas detectada em amostra tecidular. Não observamos uma completa concordância das alterações genéticas detectadas no tecido tumoral e no plasma. Isto poderá dever-se a motivos técnicos ou biológicos.Costa, Luís António Marques daFonseca, Maria do Carmo Salazar Velez Roque daRepositório da Universidade de LisboaDias, Inês Isabel Vendrell Vidal2019-09-09T15:46:25Z2019-04-032019-04-03T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/39454TID:202210685enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:38:16Zoai:repositorio.ul.pt:10451/39454Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:53:21.330963Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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