Survey of genomic features that putatively contribute to antimicrobial resistance in Chlamydia trachomatis

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Silva, Jorge Luís Almeida Costa da
Data de Publicação: 2022
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/59186
Resumo: Tese de Mestrado, Microbiologia Aplicada, 2023, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências
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spelling Survey of genomic features that putatively contribute to antimicrobial resistance in Chlamydia trachomatisChlamydia trachomatisResistência antimicrobianaGenótipos-ompAPCR multiplexSequenciação de Nova GeraçãoTeses de mestrado - 2023Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências BiológicasTese de Mestrado, Microbiologia Aplicada, 2023, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasAs infeções sexualmente transmissíveis (IST) abrangem um amplo conjunto de síndromes com quadros clínicos variados, sendo Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis e Treponema pallidum os principais responsáveis pelas IST curáveis. Entre estas, destaca-se C. trachomatis com uma estimativa de 129 milhões de novos casos por ano. C. trachomatis pode ser classificada em 15 principais genótipos (A – C, D – K, L1 – L3), com base no polimorfismo do gene ompA. Estes genótipos-ompA, geralmente, apresentam uma correlação com tropismo tecidular específico para diferentes tipos de mucosas, em vários locais anatómicos. As infeções por C. trachomatis podem ser tratadas facilmente com antibióticos, como azitromicina (classe dos macrólidos), doxiciclina (classe das tetraciclinas) e ainda fluoroquinolonas. No entanto, C. trachomatis pode ser detetada após tratamento antimicrobiano, algo que costuma ser relacionado com reinfeção ou falta de compromisso com o tratamento prescrito pelo médico. Contudo, a possibilidade de ocorrer resistência antimicrobiana (RAM) tem de ser considerada, devido à sua emergência em agentes etiológicos de outras IST, havendo assim necessidade de investigar a ocorrência deste fenómeno em C. trachomatis. Uma vez que o diagnóstico de rotina é efetuado por testes de amplificação de ácidos nucleicos (NAATs), não é possível realizar ensaios fenotípicos para determinar a ocorrência de resistência aos antibióticos utilizados no tratamento das infeções por C. trachomatis. Deste modo, é necessário desenvolver e implementar sistemas moleculares que possibilitem obter informação sobre este fenómeno, de forma a que a determinação da potencial ocorrência de resistências possa ser efetuada ao nível do diagnóstico de rotina desta infeção. Na presente dissertação de mestrado, foi desenvolvida uma nova abordagem, baseada numa metodologia PCR Multiplex, tendo em vista a amplificação de genes-alvo potencialmente associados à ocorrência de resistência aos antibióticos em C. trachomatis (locus 23S rRNA, associado à resistência a macrólidos, genes gyrA e parC, associados à resistência a fluoroquinolonas). Neste sistema, para além dos genes potencialmente relacionados com RAM, foram também explorados genes que, em conjunto com o gene ompA, permitem realizar inferências relativas à filogenia e à estrutura genómica de C. trachomatis. Para este efeito, procedeu-se ao estudo do gene CT442, do gene pmpH e de uma região a montante do gene CT105. Para tal, foram estabelecidos critérios de seleção das estirpes a estudar, sendo a existência de amostra biológica que possibilitasse efetuar a cultura das estirpes (para eventual estudo fenotípico) o principal critério de prioridade. Procedeu-se à cultura de 251 estirpes, tendo sido recuperadas 119. Foram assim selecionadas 503 estirpes para o estudo, abrangendo os genótipos-ompA Da (n=24), E (n=9), F (n=4), G (n=10), J (n=5), L2 (n=297), L2b (n=139) e o genótipo-ompA recombinante L2b/Da (n=15). A amplificação dos 6 genes-alvo foi seguida por sequenciação de nova geração (NGS), usando a tecnologia Illumina, e análise bioinformática, de forma a pesquisar a ocorrência de mutações previamente reportadas nestas regiões. O número de sequências geradas por locus foi variável, tendo sido geradas 503 sequências para os loci 23S rRNA e gyrA, 216 para o gene parC, 189 para a região a montante do gene CT105, 337 para o gene pmpH e 247 para o gene CT442. De forma a aferir a existência de mutações que contribuam putativamente para a resistência a macrólidos, foram pesquisadas as mutações A2057G, A2058G e A2059G, no locus 23S rRNA. As mutações Ser83Ile e Arg83Gly também foram pesquisadas, nos genes gyrA e parC, respetivamente, de forma a aferir a existência de mutações que potencialmente contribuam para resistência a fluoroquinolonas. Relativamente aos loci relacionados com a estrutura genómica, foi pesquisada uma inserção de 74 pares de bases (pb), potencialmente específica de estirpes LGV, na região a montante do promotor do gene CT105. Também foi pesquisada uma inserção de 9 pb no gene pmpH, putativamente específica das estirpes L2b. Relativamente ao gene CT442, mutações pontuais nesta região permitiram a construção de uma árvore filogenética das estirpes clínicas analisadas. Após análise das sequências obtidas, não foram detetadas mutações associadas à resistência a macrólidos em qualquer das estirpes, tendo sido apenas identificadas 4 estirpes com mutações suscetíveis de promover resistência às fluoroquinolonas. Tais estirpes correspondiam a mutantes do genótipo L2b/Da (como já teria sido reportado) e L2, sendo que os resultados obtidos no presente trabalho constituem a primeira observação desta potencial resistência, neste genótipo. A presença destas mutações numa estirpe com genótipo-ompA L2 pode sugerir um aumento da circulação de estirpes potencialmente resistentes, e também a necessidade de desenvolver ensaios fenotípicos que afiram, de facto, a resistência às fluoroquinolonas nestas estirpes. A sequenciação da região a montante do gene CT105, permitiu verificar a elevada especificidade desta região na discriminação de estirpes LGV e não-LGV. Relativamente à inserção específica das estirpes L2b, localizada no gene pmpH, verificou-se que 96,02% das estirpes L2 apresentavam este marcador genético. A filogenia com base nas mutações do gene CT442 foi consistente com os resultados obtidos para os restantes loci, revelando uma vez mais que os genótipos-ompA nem sempre refletem a estrutura genómica das estirpes de C. trachomatis. Estes resultados sugerem que o sistema multiplex explorado na presente dissertação permitirá uma potencial maior robustez na determinação da estrutura genómica de C. trachomatis. Por outro lado, foram evidenciados padrões de recombinação que suscitam a necessidade de investigação futura, nomeadamente por sequenciação completa do genoma (WGS). Estes padrões de recombinação foram detetados em estirpes com potencial estrutura genómica de uma estirpe L2b que apresentam uma reversão para o genótipo-ompA L2 (mantendo as características clínicas de estirpes L2b). Este padrão de recombinação já foi reportado no passado, no contexto de um aumento dos casos de infeção por estirpes L2, no contexto da epidemia de estirpes L2b. Foi ainda detetada uma estirpe com genótipo-ompA não-LGV que nos restantes loci apresentava um perfil típico de uma estirpe LGV nos restantes loci, podendo potencialmente constituir um novo híbrido, tal como recentemente reportado em Portugal e noutros países. Em resumo, os resultados da presente dissertação permitiram identificar estirpes de C. trachomatis potencialmente resistentes às fluoroquinolonas em Portugal, assim como desenvolver um sistema PCR Multiplex aliado a NGS que melhor caracteriza as estirpes desta espécie em termos filogenéticos, para além de permitir detetar eventuais estirpes mutantes/recombinantes, o que sugere a sua utilização como um novo paradigma de classificação das estirpes de C. trachomatis com enorme interesse nos estudos de epidemiologia molecular.Chlamydia trachomatis is the leading cause of bacterial sexually transmitted infections (STI), with an estimation of 131 million new episodes per year. C. trachomatis can be classified into 15 main genotypes (A – C, D – K, L1 – L3), based on the polymorphism of the ompA gene. These ompAgenotypes generally correlate with specific tissue tropisms for different mucosal sites. Chlamydial infections can be treated with antibiotics such as macrolides (azithromycin), tetracyclines (doxycycline) or fluoroquinolones. However, C. trachomatis is often detected post-treatment, a situation usually related with either reinfection or lack of treatment compliance; nevertheless, antimicrobial resistance cannot be excluded, and this is a phenomenon that requires further elucidation. In the present MSc dissertation, a novel Multiplex PCR approach was developed for the amplification of target genes potentially driving AMR (23S rRNA locus, gyrA and parC) along with genes that, together with ompA, allow to infer C. trachomatis type and genomic backbone (a region upstream CT105, CT442 and pmpH), followed by NGS and bioinformatic analysis. A total of 503 strains were studied, with no strains evidencing genotypic resistance to macrolides, while 4 mutants could be potentially resistant to fluoroquinolones. Sequencing of a region upstream CT105, CT442 and pmpH loci further allowed inferring the potential genomic backbone and phylogeny of C. trachomatis strains, evidencing recombination patterns that warrant future investigation (namely by WGS), such as strains with potential L2b genomic backbone that reverted to an L2 ompA-genotype and a strain with a non-LGV ompA-genotype that displays LGV-like profiles in other loci. Furthermore, a putative LGV-specific indel was determined to be highly specific in LGV/non-LGV C. trachomatis strain discrimination. In summary, the NGS-based multiplex approach developed in this exploratory study might be a suitable and informative complement of traditional C. trachomatis genotyping, towards an enhanced C. trachomatis molecular epidemiology.Borrego, Maria José Gonçalves GasparCunha, Mónica VieiraRepositório da Universidade de LisboaSilva, Jorge Luís Almeida Costa da202320222024-12-30T00:00:00Z2023-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/59186enginfo:eu-repo/semantics/embargoedAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T17:08:12Zoai:repositorio.ul.pt:10451/59186Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T22:09:09.858867Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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