Genome editing to be applied in functional characterization of genetic variants in familial breast cancer patients

• Autor(a) principal: Pedro, Ana Rita Serra
• Data de Publicação: 2021
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: eng
• Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10362/114625
• topic: BRCA1; Cancro da mama familiar; CRISPR-Cas9; MCF10-A; MCF-7; Variante de significado desconhecido (VUS); BRCA1; CRISPR-Cas9; Familial Breast Cancer; MCF10-A; MCF-7; Variants of Unknown Significance (VUS); Ciências Médicas

RESUMO: O cancro da mama (CM) familiar representa 15% de todos os casos de CM, estando principalmente relacionado a variantes hereditárias nos genes BRCA. Vários genes ligados ao CM estão sobretudo relacionados com a Recombinação Homóloga (RH), a principal via de reparação de quebras de cadeia-dupla de DNA. A presença de variantes genéticas nestes genes, como o BRCA1 e BRCA2, pode comprometer a RH e consequentemente o desenvolvimento da doença. No cancro da mama familiar, o aconselhamento genético e a triagem através de testes genéticos têm se tornado padrão, aumentando a deteção de variantes de significado desconhecido (VUS). O efeito biológico atribuído às VUS é pouco claro, sendo necessários ensaios funcionais para caracterizar o seu significado clínico. Num estudo anterior, uma VUS foi identificada no gene BRCA1 em pacientes saudáveis, mas com histórico familiar de cancro relevante. Para estudar a sua relevância funcional, implementamos um modelo in vitro com linhas celulares de mama (MCF10-A e MCF-7) para introduzir a VUS de interesse com uma ferramenta de edição genómica, CRISPR-Cas9 e avaliar a resposta celular através de um desafio genotóxico com doxorrubicina (DOX). Introduzimos com sucesso a VUS como clone heterozigoto nas MCF10-A. Várias metodologias foram selecionadas para avaliar e comparar a resposta celular às lesões genéticas: ensaios do Cometa, ɣ-H2AX e Anexina V. Adicionalmente, avaliamos a expressão relativa da proteína através de Western Blot. Os resultados do ensaio do cometa mostram uma diminuição da sensibilidade à DOX no MCF10-A VUS, porém, no ensaio ɣ-H2AX, observamos um maior % de quebras e cadeia-dupla. Na Anexina V, o MCF10- A VUS apresentou menor % de células em necrose. Por último, a expressão da proteína BRCA1 encontra-se diminuída nas MCF10-A VUS. No geral, os resultados mostram uma diminuição da suscetibilidade à DOX para a linha celular com a VUS, sugerindo um efeito benigno. No entanto, são necessários mais ensaios funcionais para entender o seu papel no risco de cancro.