Vesículas extracelulares de Leishmania amazonensis: activação de macrófagos murinos e antigenicidade
Autor(a) principal: | |
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Data de Publicação: | 2021 |
Tipo de documento: | Dissertação |
Idioma: | por |
Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10362/138130 |
Resumo: | Leishmanioses são um grupo de doenças, causadas por protozoários do gênero Leishmania, transmitidos ao homem e outros mamíferos através da picada de fêmeas de flebotomíneos infectadas. Há duas formas clínicas principais da doença: leishmaniose visceral (LV) e leishmaniose tegumentar (LT), sendo a última subdividida em leishmaniose cutânea, leishmaniose muco-cutânea, leishmaniose difusa e leishmaniose disseminada. As leishmanioses pertencem ao grupo de doenças negligenciadas, que são responsáveis pela morte e incapacidade de milhões de pessoas por ano, evidenciando uma necessidade de atenção. O papel das vesículas extracelulares (VEs) de parasitas do gênero Leishmania tem sido amplamente estudado, uma vez que, nos últimos anos, os resultados apontam para uma função imunomoduladora favorável à infecção. Este trabalho teve como objetivo analisar a imunogenicidade das proteínas das VEs de formas promastigotas de três estirpes de L. amazonensis e investigar o efeito das VEs na ativação de macrófagos murinos. Este estudo foi constituído por três etapas: (i) VEs de culturas axênicas de promastigotas de L. amazonensis, estirpes M2269, BA125 e BA336, foram purificadas; (ii) foi analisado o efeito das VEs na atividade dos MØ, pela quantificação da produção de ureia, através de ensaios colorimétricos e pela produção de IL-1β; a atividade dos MØ como células apresentadoras de antígeno foi avaliada indiretamente, através da expressão de moléculas de classe I (MHC I) e de classe II (MHC II) do complexo maior de histocompatibilidade, por citometria de fluxo; (iii) foi estudado o perfil e imunorreatividade das proteínas das VEs, utilizando como ferramentas a eletroforese de proteínas em gel de poliacrilamida na presença de SDS (SDS-PAGE), a eletroforese bidimensional (2-DE) e teste de Western-blot das proteínas, utilizando soro de camundongos infectados por L. amazonensis e soro de humanos portadores de Leishmaniose tegumentar americana (LTA). Os MØ estimulados com VEs a 7,09μg/μL produziram significativamente mais ureia que o controlo negativo. A estimulação com VEs provocaram, nos MØ, a redução da produção de IL-1β, em relação à produção basal do controle negativo. As VEs de L. amazonensis não interferem com a expressão das moléculas de classe I e II do MHC. A eletroforese das VEs em SDS-PAGE evidenciou um perfil proteico semelhante nas estirpes BA125 e BA336, mas diferente na estirpe M2269. As VEs possuem proteínas que foram reconhecidas por anticorpos de camundongos BALB/c previamente infetados com L. amazonensis, assim como por anticorpos de humanos portadores de LTA. As VEs de L. amazonensis partilham proteínas com o parasita, nomeadamente a proteína de superfície gp63 e a proteína citoplasmática HSP70, não promovem ambientes pro-inflamatórios e evitam estimular a apresentação antigênica, minimizando a actividade da imunidade celular e favorecendo a infecção e a sobrevivência do parasita. Estudos futuros são necessários para clarificar os efeitos das VEs na LTA, incluindo a identificação de outras proteínas, que podem exercer um papel importante no microambiente imunitário. |
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Vesículas extracelulares de Leishmania amazonensis: activação de macrófagos murinos e antigenicidadeParasitologia médicaLeishmania amazonensisVesículas extracelularesPolarização de macrófagosAntigenicidadeDomínio/Área Científica::Ciências MédicasLeishmanioses são um grupo de doenças, causadas por protozoários do gênero Leishmania, transmitidos ao homem e outros mamíferos através da picada de fêmeas de flebotomíneos infectadas. Há duas formas clínicas principais da doença: leishmaniose visceral (LV) e leishmaniose tegumentar (LT), sendo a última subdividida em leishmaniose cutânea, leishmaniose muco-cutânea, leishmaniose difusa e leishmaniose disseminada. As leishmanioses pertencem ao grupo de doenças negligenciadas, que são responsáveis pela morte e incapacidade de milhões de pessoas por ano, evidenciando uma necessidade de atenção. O papel das vesículas extracelulares (VEs) de parasitas do gênero Leishmania tem sido amplamente estudado, uma vez que, nos últimos anos, os resultados apontam para uma função imunomoduladora favorável à infecção. Este trabalho teve como objetivo analisar a imunogenicidade das proteínas das VEs de formas promastigotas de três estirpes de L. amazonensis e investigar o efeito das VEs na ativação de macrófagos murinos. Este estudo foi constituído por três etapas: (i) VEs de culturas axênicas de promastigotas de L. amazonensis, estirpes M2269, BA125 e BA336, foram purificadas; (ii) foi analisado o efeito das VEs na atividade dos MØ, pela quantificação da produção de ureia, através de ensaios colorimétricos e pela produção de IL-1β; a atividade dos MØ como células apresentadoras de antígeno foi avaliada indiretamente, através da expressão de moléculas de classe I (MHC I) e de classe II (MHC II) do complexo maior de histocompatibilidade, por citometria de fluxo; (iii) foi estudado o perfil e imunorreatividade das proteínas das VEs, utilizando como ferramentas a eletroforese de proteínas em gel de poliacrilamida na presença de SDS (SDS-PAGE), a eletroforese bidimensional (2-DE) e teste de Western-blot das proteínas, utilizando soro de camundongos infectados por L. amazonensis e soro de humanos portadores de Leishmaniose tegumentar americana (LTA). Os MØ estimulados com VEs a 7,09μg/μL produziram significativamente mais ureia que o controlo negativo. A estimulação com VEs provocaram, nos MØ, a redução da produção de IL-1β, em relação à produção basal do controle negativo. As VEs de L. amazonensis não interferem com a expressão das moléculas de classe I e II do MHC. A eletroforese das VEs em SDS-PAGE evidenciou um perfil proteico semelhante nas estirpes BA125 e BA336, mas diferente na estirpe M2269. As VEs possuem proteínas que foram reconhecidas por anticorpos de camundongos BALB/c previamente infetados com L. amazonensis, assim como por anticorpos de humanos portadores de LTA. As VEs de L. amazonensis partilham proteínas com o parasita, nomeadamente a proteína de superfície gp63 e a proteína citoplasmática HSP70, não promovem ambientes pro-inflamatórios e evitam estimular a apresentação antigênica, minimizando a actividade da imunidade celular e favorecendo a infecção e a sobrevivência do parasita. Estudos futuros são necessários para clarificar os efeitos das VEs na LTA, incluindo a identificação de outras proteínas, que podem exercer um papel importante no microambiente imunitário.Leishmaniasis is a group of diseases, caused by protozoa of the genus Leishmania, which is transmitted to man and other mammals through the bite of selected sand flies. There are two clinical forms of the disease: visceral leishmaniasis (VL) and cutaneous leishmaniasis (CL). CL is subdivided into cutaneous leishmaniasis, mucocutaneous leishmaniasis, diffuse leishmaniasis, and disseminated leishmaniasis. They belong to the neglected diseases group, which is responsible for millions of people’s death and disability each year, highlighting the need for attention. The role of extracellular vesicles (EVs) from Leishmania parasites has been widely studied since, in recent years, results have pointed to an immunomodulatory function favorable to infection. This work aimed to analyze the immunogenicity of EV proteins from promastigote forms of three L. amazonensis strains and investigate the effect of their EVs in the activation of murine macrophages. This study was organized in three phases: (i) EVs from axenic cultures of L. amazonensis promastigotes, strains M2269, BA125, and BA336 were purified; (ii) the effect of VEs on MØ activity was analyzed by quantifying urea through colorimetric assays and IL-1β production, and the activity of MØ as antigen-presenting cells was indirectly evaluated through the expression of class I (MHC I) and class II (MHC II) molecules of the major histocompatibility complex by flow cytometry. Finally, EVs proteins’ profile and immunoreactivity were investigated by electrophoresis in polyacrylamide gel in the presence of SDS (SDS-PAGE), two-dimensional electrophoresis (2-DE) and Western-blot test using serum from mice infected with L. amazonensis and serum from humans with American Cutaneous Leishmaniasis (ATL). MØ stimulated with EVs a 7,09μg/μL produced more urea than the negative control. The stimulation with EVs caused in MØ a reduction in the production of IL-1β, concerning the basal production of the negative control. L. amazonensis EVs do not interfere with the expression of class I and II molecules of MHC. EV electrophoresis on SDS-PAGE showed a similar protein profile in strains BA125 and BA336, but different in strain M2269. EVs have proteins that are recognized by BALB/c mice previously infected with L. amazonensis and by humans with ATL. L. amazonensis EVs share antigens with the parasite, such as the surface gp63 and the cytoplasmic HSP70, do not promote pro-inflammatory environments and avoid stimulating antigenic presentation, minimizing the activity of cellular immunity, favoring infection and parasite survival. Further studies are needed to clarify the effects of EVs on LTA, including the identification of other proteins which can play an important role in the immune microenvironment.SANTOS-GOMES, GabrielaANDRADE, Hélida Monteiro deRUNFREITAS, Bruna Eugênia de2021-122021-122021-12-01T00:00:00Z2025-04-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10362/138130TID:203010574porinfo:eu-repo/semantics/embargoedAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2024-03-11T05:15:27Zoai:run.unl.pt:10362/138130Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-20T03:48:57.977713Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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Leishmanioses são um grupo de doenças, causadas por protozoários do gênero Leishmania, transmitidos ao homem e outros mamíferos através da picada de fêmeas de flebotomíneos infectadas. Há duas formas clínicas principais da doença: leishmaniose visceral (LV) e leishmaniose tegumentar (LT), sendo a última subdividida em leishmaniose cutânea, leishmaniose muco-cutânea, leishmaniose difusa e leishmaniose disseminada. As leishmanioses pertencem ao grupo de doenças negligenciadas, que são responsáveis pela morte e incapacidade de milhões de pessoas por ano, evidenciando uma necessidade de atenção. O papel das vesículas extracelulares (VEs) de parasitas do gênero Leishmania tem sido amplamente estudado, uma vez que, nos últimos anos, os resultados apontam para uma função imunomoduladora favorável à infecção. Este trabalho teve como objetivo analisar a imunogenicidade das proteínas das VEs de formas promastigotas de três estirpes de L. amazonensis e investigar o efeito das VEs na ativação de macrófagos murinos. Este estudo foi constituído por três etapas: (i) VEs de culturas axênicas de promastigotas de L. amazonensis, estirpes M2269, BA125 e BA336, foram purificadas; (ii) foi analisado o efeito das VEs na atividade dos MØ, pela quantificação da produção de ureia, através de ensaios colorimétricos e pela produção de IL-1β; a atividade dos MØ como células apresentadoras de antígeno foi avaliada indiretamente, através da expressão de moléculas de classe I (MHC I) e de classe II (MHC II) do complexo maior de histocompatibilidade, por citometria de fluxo; (iii) foi estudado o perfil e imunorreatividade das proteínas das VEs, utilizando como ferramentas a eletroforese de proteínas em gel de poliacrilamida na presença de SDS (SDS-PAGE), a eletroforese bidimensional (2-DE) e teste de Western-blot das proteínas, utilizando soro de camundongos infectados por L. amazonensis e soro de humanos portadores de Leishmaniose tegumentar americana (LTA). Os MØ estimulados com VEs a 7,09μg/μL produziram significativamente mais ureia que o controlo negativo. A estimulação com VEs provocaram, nos MØ, a redução da produção de IL-1β, em relação à produção basal do controle negativo. As VEs de L. amazonensis não interferem com a expressão das moléculas de classe I e II do MHC. A eletroforese das VEs em SDS-PAGE evidenciou um perfil proteico semelhante nas estirpes BA125 e BA336, mas diferente na estirpe M2269. As VEs possuem proteínas que foram reconhecidas por anticorpos de camundongos BALB/c previamente infetados com L. amazonensis, assim como por anticorpos de humanos portadores de LTA. As VEs de L. amazonensis partilham proteínas com o parasita, nomeadamente a proteína de superfície gp63 e a proteína citoplasmática HSP70, não promovem ambientes pro-inflamatórios e evitam estimular a apresentação antigênica, minimizando a actividade da imunidade celular e favorecendo a infecção e a sobrevivência do parasita. Estudos futuros são necessários para clarificar os efeitos das VEs na LTA, incluindo a identificação de outras proteínas, que podem exercer um papel importante no microambiente imunitário. |
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