Impact of the human Golgi anti-apoptotic protein (hGAAP/TMBIM4) in Glioblastoma progression

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Martins, Marta Filipa Malheiro
Data de Publicação: 2021
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/51956
Resumo: Tese de mestrado, Oncobiologia, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2021
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spelling Impact of the human Golgi anti-apoptotic protein (hGAAP/TMBIM4) in Glioblastoma progressionGliomaTransmembrane BAX Inhibitor Motif-containing (TMBIM)Invasão celularCanal iónicoBioinformáticaTeses de mestrado - 2021Domínio/Área Científica::Ciências MédicasTese de mestrado, Oncobiologia, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2021The progression and severity of gliomas are strongly associated with their ability to spread and invade other tissues. Along with drug targeting constraints, the high level of heterogeneity hampers the development of broad therapeutic strategies. Several members of the Transmembrane BAX Inhibitor Motif-containing (TMBIM) family of transmembrane proteins can modulate various cellular processes central to cancer progression. These include apoptosis resistance, promotion of cell motility, extracellular matrix (ECM) remodelling, and changes in the cellular metabolic status. This works aims at exploring the impact of members of this family of proteins on glioma progression. Gene expression (mRNA) and patient survival bioinformatics analysis was performed, using the TCGA (The Cancer Genome Atlas), CGGA (Chinese Glioma Genome Atlas), and Ivy GAP (Ivy Glioblastoma Atlas Project) databases. Four glioblastoma multiforme (GBM) cells lines (8-MG, U- 87MG, U251 e GL15) were used as models. To explore the mechanisms underlying the effects of TMBIM4 upregulation of TMBIM4 in glioma progression, cells were transfected with TMBIM4-specific siRNAs. Two- and three-dimensional cell invasion were assessed by ECM-coated transwell and ECM-embedded spheroid assays, respectively. Gene expression analysis indicated that the level of most TMBIMs mRNAs is dysregulated in gliomas. Particularly, TMBIM1, 4 and 6 are upregulated in GBM when compared with normal tissues. The increased expression of TMBIM1, 4 and 6 positively is associated with glioma grade. All three genes are overexpressed in the mesenchymal and neural GBM subtypes. Laser-dissected GBM tissue analysis (Ivy GAP) confirmed the increased levels of TMBIM1 and 4 in the cellular tumour vs tumour edge. Importantly, high levels of TMBIM1 and 4 are associated with a significant reduction in the survival of low-grade glioma patients but not of GBM patients. These data suggest a possible role for TMBIM1 and 4 in glioma progression. The downregulation of TMBIM4 provoked a strong inhibition of 2D cell invasion in three GBM cell lines tested (U-87MG, U251, GL 15), without affecting cell viability. TMBIM4 knock-down also leads to a robust reduction of 3D cell invasion in U87 cells. U87 cells with reduced TMBIM4 expression have a smaller size and an increased number of cell protrusions when compared with control cells. Ongoing studies aim at evaluating the effect of TMBIM4 expression in glioma in vivo invasion and at dissecting the molecular mechanisms involved. Here, data is presented that support further exploration of TMBIM1 and TMBIM4 as potential novel markers for glioma progression. Thus, contributing to the refinement of glioma diagnosis and possibly to the development of new therapeutic strategiesDe acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), em 2019 o cancro foi considerado uma das principais causas de morte em pessoas com menos de 70 anos. Em 2020, os dados estatísticos revelados pela Agência Internacional de Pesquisa sobre o Cancro (IARC) registaram mundialmente cerca de 19,3 milhões de novos casos e 9,9 milhões de mortes devido ao cancro. Dos diversos tumores avaliados, os tumores associados ao cérebro e ao sistema nervoso central (SNC) representaram cerca de 1,6 % dos novos casos e 2,5 % do total de mortes relacionadas com o cancro. Sendo dos principais responsáveis pela mortalidade dos tumores cerebrais, os gliomas representam cerca de 80% dos tumores malignos primários do SNC. De acordo com a classificação mais recente da OMS (2016), os gliomas são agrupados em categorias de acordo com a sua análise microscópica (padrões histológicos) e com os seus parâmetros moleculares (mutações IDH, co-deleção 1p / 19q, mutação ATRX e TERT). Esta classificação permite que os patologistas classifiquem os gliomas em diferentes graus de malignidade (grau I-IV), e desta forma é possível promover uma melhoria no diagnóstico e na terapia a ser aplicada. O Glioblastoma multiforme (GBM) representa cerca de 54% dos gliomas e é classificado de acordo com a OMS como grau IV. É tipicamente dividido em tipo primário (glioblastoma IDH-wild-type) ou secundário (glioblastoma IDH-mutant), sendo que os dois são caracterizados por alterações em diferentes vias de sinalização, têm impacto distinto consoante as faixas etárias e diferem consequentemente, no prognóstico e na resposta à terapêutica. O GBM é ainda dividido em quatro subtipos: proneural, neural, mesenquimal e clássico. Este tipo de tumor infiltrativo de glioma é caracterizado por ser bastante heterogéneo, tendo fortes variações genéticas e epigenéticas dentro da sua população de células tumorais. A sua progressão e agressividade está intimamente associada à capacidade de as suas células se espalharem e invadirem tecidos adjacentes, o que, em conjunto com as elevadas restrições no direcionamento de fármacos, torna o desenvolvimento de estratégias terapêuticas eficazes um desafio. Os pacientes com este tipo de tumor enfrentam uma morbilidade e mortalidade significativa com uma sobrevida global mediana de cerca de apenas 15 meses. As estratégias terapêuticas utilizadas atualmente em pacientes com GBM são consideradas complexas e podem incluir a ressecção cirúrgica seguida de radioterapia (RT) e muitas vezes complementada com ciclos de quimioterapia com Temozolomida (TMZ). Esta combinação de RT com TMZ demonstrou ser uma abordagem terapêutica mais eficaz, que permite o aumento da sobrevida global mediana do paciente na faixa de 16 meses. Contudo, frequentemente após a ressecção do tumor, existem células invasivas que permanecem resistentes à radio e quimioterapia, e que são a principal causa de recidiva tumoral. Os eventos celulares relacionados com a proliferação celular, sobrevivência/resistência à apoptose e motilidade são particularmente relevantes neste tipo de tumores altamente heterogenéticos e invasivos, sendo que os mecanismos celulares envolvidos na invasão de GBM incluem processos bioquímicos e biofísicos que afetam a morfologia e a motilidade celular com impacto na remodelação da matriz extracelular (MEC). O microambiente tumoral também é descrito como um componente essencial, responsável pela secreção de fatores de crescimento, contribuindo para um aumento da progressão tumoral. Desta forma, existem diversas vias de sinalização relacionadas à progressão tumoral que se encontram a ser exploradas no GBM, sendo que uma delas é o possível envolvimento de canais iónicos neste processo. Os iões de cálcio (Ca2+) são importantes segundos mensageiros intracelulares que regulam diferentes processos celulares, incluindo o ciclo celular, motilidade, apoptose, metabolismo e transcrição génica. No cérebro, o fluxo de Ca2+ é responsável por regular as funções dos neurónios e seu movimento está associado à resposta a estímulos. O influxo de Ca2+ pode ocorrer diretamente pela ativação do recetor de Ca2+ ROCE (receptor-operated Ca2+ entry) ou quando existe uma redução níveis de Ca2+ nos principais armazenamentos intracelulares, em que são ativados os canais de SOCE (store-operated Ca2+ entry) de forma a promover a homeostasia. Elevados níveis de ativação de SOCE foram detetados no GBM primário, e esta ativação tem sido correlacionada com o aumento da progressão tumoral. A família Transmembrane BAX Inhibitor Motif-containing family (TMBIM) é composta por seis membros conhecidos no reino animal. São proteínas transmembranares, altamente conservadas ao longo da evolução, com diferentes localizações sub-celulares. Estas proteínas têm sido descritas como canais iónicos e são capazes de afetar diretamente e indiretamente os fluxos celulares de Ca2+. Diversos membros desta família de proteínas foram descritos como sendo capazes de modular vários processos celulares centrais para a progressão tumoral. Estes processos incluem resistência à apoptose, alterações na motilidade celular, remodelação da matriz extracelular (MEC) e alterações no metabolismo celular. A TMBIM4, também conhecida como proteína anti-apoptotica do Golgi humano (hGAAP), é uma proteína membranar do complexo de Golgi que funciona como canal iónico, servindo como modeladora dos níveis de Ca2+ celular neste organelo. A TMBIM4 diminui os níveis de Ca2+ neste organelo e de forma a compensar esta diminuição, a célula ativa mecanismos de SOCE que promove a entrada de Ca2+ extracelular, sendo que esta acumulação ocorre em microdomínios junto à membrana citoplasmática levando à rápida reciclagem de adesões focais e consequentemente a um aumento da motilidade celular. Deste modo, o principal objetivo deste projeto é explorar o envolvimento das proteínas TMBIM na progressão do glioma. O segundo e mais específico objetivo deste projeto é investigar o impacto da TMBIM4 nos processos celulares relacionados à progressão de glioblastoma. Um conjunto de análises bioinformáticas da expressão génica (mRNA) e da sobrevida global mediana dos pacientes foi realizada, recorrendo às bases de dados TCGA (The Cancer Genome Atlas), CGGA (Chinese Glioma Genome Atlas), e Ivy GAP (Ivy Glioblastoma Atlas Project), de forma avaliar a existência de uma possível desregulação de algum membro desta família nos diversos tumores. Quatro linhas celulares de glioblastoma (8-MG, U-87MG, U251 e GL15) foram utilizadas como modelos. Para explorar os mecanismos subjacentes aos efeitos da regulação positiva de TMBIM4 na progressão de glioma, as células foram transfectadas com siRNAs (RNA interferência) específicos de TMBIM4, de forma a obter um silenciamento eficiente da TMBIM4. A invasão de células em 2D e 3D foi avaliada por ensaios em transwells revestidos com MEC e por ensaios de esferoides incorporados em MEC. A análise da expressão génica indicou que os níveis de mRNAs da maioria dos membros da família TMBIM encontram-se desregulados em gliomas. Particularmente, os mRNAs de TMBIM1, 4 e 6 são expressos em maior quantidade no GBM, quando comparados com o tecido normal. Este aumento da expressão de TMBIM1, 4 e 6 correlaciona-se com o aumento do grau de glioma, e quando a expressão nos diversos subtipos de GBM foi avaliada, verifica-se que é no subtipo mesenquimal e neural que existe a maior expressão destes três membros da família TMBIM. Para compreender melhor como variam os níveis de mRNA dentro do tecido tumoral e no seu redor, utilizou-se a plataforma online Ivy GAP. Esta base de dados exclusiva de GBM contem a análise de mRNA de tecido dissecado a laser (amostras de mRNA de pacientes). Os resultados confirmaram os níveis aumentados de TMBIM1 e 4 no tecido tumoral e também se verificou um aumento de expressão na componente vascular do tecido. É importante também a análise bioinformática permitiu concluir que altos níveis de mRNA de TMBIM1 e 4 estão associados a uma redução significativa na sobrevida global mediana de pacientes com glioma de baixo grau, mas não de pacientes com GBM. O silenciamento da TMBIM4 provocou uma forte inibição da invasão de celular em ensaios in vitro 2D em três das linhas de GBM testadas (U-87MG, U251, GL15), sem que fosse afetado a viabilidade celular das mesmas. O silenciamento da TMBIM4 levou a uma grande redução da invasão celular 3D na linha celular U87. As células U87 com expressão reduzida de TMBIM4 apresentaram ainda um tamanho mais reduzido e um aumento do número de protusões celulares formadas, quando comparadas com o controlo. Ensaios que estão a decorrer têm como objetivo avaliar o efeito da expressão de TMBIM4 na invasão in vivo de células de glioma e pretendem contribuir para a disseção dos mecanismos moleculares envolvidos. Em suma, os dados apresentados justificam uma exploração adicional de TMBIM1 e TMBIM4 como potenciais biomarcadores para a progressão de glioma. Assim, contribuindo para o diagnóstico de glioma e possivelmente para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticasO trabalho realizado no âmbito desta dissertação foi financiado pelas seguintes instituições: FCT grant UID/DTP/04567/2019 (CBIOS funding); EuroCellNet COST action (Short term scientific mission Grant to Marta Martins)Saraiva, Nuno Ricardo de AlmeidaGomes, Edgar Rodrigues AlmeidaRepositório da Universidade de LisboaMartins, Marta Filipa Malheiro2021-06-152024-06-15T00:00:00Z2021-06-15T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/51956TID:202756556enginfo:eu-repo/semantics/embargoedAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:56:59Zoai:repositorio.ul.pt:10451/51956Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T22:03:08.997392Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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