Assessment of DNA damage in cumulus cells of infertile women
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|---|---|
| Data de Publicação: | 2022 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | eng |
| Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10316/104483 |
Resumo: | Dissertação de Mestrado em Genética Clínica Laboratorial apresentada à Faculdade de Medicina |
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Assessment of DNA damage in cumulus cells of infertile womenAvaliação do dano do DNA em células do cúmulus de mulheres inférteisinfertilidade femininacélulas do cúmulosensaio cometadano no DNAfemale infertilitycumulus cellscomet assayDNA damageDissertação de Mestrado em Genética Clínica Laboratorial apresentada à Faculdade de MedicinaA infertilidade afeta aproximadamente 15% dos casais e em todo o mundo, mais de 8 milhões dos nascimentos resultaram do sucesso de técnicas de reprodução medicamente assistida. Estudos recentes, utilizando o ensaio cometa para avaliar o dano do DNA nos espermatozoides, demonstraram que um elevado nível de fragmentação no DNA afeta a capacidade reprodutiva. Contudo, a aplicação do ensaio cometa na infertilidade feminina continua escassa. O ensaio de cometa é um método simples, versátil e barato utilizado para detetar quebras na cadeia de DNA e locais alkali-labile. Uma das limitações desta técnica é a variabilidade dos resultados que parece ser influenciada por inúmeros fatores nas diversas fases deste procedimento. Assim, a otimização do ensaio cometa foi realizada em amostras de sangue total e todas as etapas desta técnica foram analisadas. O precoating, a concentração de agarose de baixo ponto de fusão e Triton X-100, as propriedades de adesão das lamelas, o uso de um controlo positivo e a sua aplicação e o sistema de contagem mostraram-se críticos para o ensaio. Em amostras congeladas, a colheita de sangue com EDTA demonstrou um efeito protetor sobre as células. A otimização do protocolo garantiu que, dentro dos parâmetros testados, as melhores condições fossem cuidadosamente escolhidas. Assim, o ensaio do cometa foi implementado em células do cúmulos. Foi possível especular que uma maior fragmentação no DNA pode estar associada a um mecanismo de apoptose mais rápido nas células do cúmulos. A análise de ambos os tecidos em amostras de dadoras de ovócitos e de mulheres inférteis revelou que em alguns casos o dano está presente em ambos os tecidos, contrariamente ao que acontece em amostras de mulheres inférteis em que o dano é observado apenas nas células do cúmulos. Enfatizando a importância de estudar estes dois tecidos e apoiando a utilização das células do cúmulos como biomarcador da infertilidade feminina.De acordo com a Associação Portuguesa de Fertilidade (https://apfertilidade.org/, acedido a 8 de julho de 2022) cerca de 10% das mulheres portuguesas sofrem de infertilidade idiopática, e sabe-se atualmente que variantes genéticas estão implicadas em cerca de 15% dos casos de infertilidade feminina. A insuficiência ovárica primária é uma das principais causas genéticas de infertilidade feminina e afeta aproximadamente 20% das mulheres com uma pré-mutação no gene FMR1. Contudo, os mecanismos patológicos e moleculares que regulam a sua influência na infertilidade não foram ainda elucidados. Considerando que a função do gene FMR1 no ovário é pouco estudada foi realizada uma análise bioinformática das vias do gene FMR1, infertilidade ovárica e resposta à fragmentação do DNA recorrendo a bases de dados. Este estudo revelou um único gene em comum, o CREB1. Este gene codifica para um fator de transcrição membro da família de proteínas que ligam o DNA “leucine zipper”. De acordo com a base de dados Harmonizome (https://maayanlab.cloud/Harmonizome/gene/CREB1), este gene apresenta 10 000 associações funcionais descritas, mas nenhuma relacionada com a (in)fertilidade feminina. Assim este resultado é sugestivo de existir uma relação do gene CREB1 e a fertilidade feminina, algo que não foi descrito anteriormente, demonstrando a sua potencialidade para futuros estudos.Infertility affects approximately 15% of couples, and worldwide, more than 8 million births have resulted from successful medically assisted reproduction techniques. Recent studies have used the comet assay to assess sperm DNA damage, demonstrating that a high level of fragmentation in DNA affects reproductive ability. However, comet assay in female infertility remains a challenge. Comet assay is a simple, versatile, and inexpensive method used to detect strand breaks and alkali-labile sites. One of the limitations of this technique is the variability of the results inter- and intra- laboratories and therefore its optimization is necessary. Optimization of the comet assay was performed in whole blood samples and all the steps of this technique were reviewed. Precoating, the concentration of low melting point agarose and Triton X-100, the strength of coverslips, the use of positive control and its application, and the counting system were shown to be critical for the assay. In frozen samples, blood collection with EDTA demonstrated a protective effect on the cells. Optimization of the protocol ensured that, within the parameters tested, the best conditions were carefully chosen. Thus, the comet assay was implemented on cumulus cells. It was possible to speculate that greater fragmentation in DNA may be associated with a faster apoptosis mechanism in cumulus cells. Analysis of both tissues in samples from oocyte donors and infertile women revealed that in some cases damage is present in both tissues, unlike in samples from infertile women where damage was observed only in the cumulus cells. Emphasizing the importance of studying these two tissues and supporting the hypothesis of using cumulus cells as a biomarker for female infertility.According to the Portuguese Fertility Association (https://apfertilidade.org/, accessed July 8, 2022) about 10% of Portuguese women suffer from ideopathic infertility, and it is now known that genetic variants are implicated in about 15% of female infertility. Primary ovarian insufficiency is a major genetic cause of female infertility and affects approximately 20% of women with a pre-mutation in the FMR1 gene. However, the molecular and pathological mechanisms regulating its influence on infertility have not yet been elucidated. Considering also that the function of the FMR1 gene in the ovary is poorly studied, a bioinformatics analysis of FMR1 gene pathways, ovarian infertility and DNA fragmentation was performed using databases. This study revealed a single gene in common in all three pathways, CREB1. This gene encodes for a transcription factor that is a member of the "leucine zipper" family of DNA-binding proteins. According to the Harmonizome database (https://maayanlab.cloud/Harmonizome/gene/CREB1), this gene has 10 000 described functional associations, but none related to female (in)fertility. Thus, this result is suggestive that there is a relationship of the CREB1 gene in fertility, something that has not been described before, demonstrating its potentiality for future studies.2022-10-11info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesishttp://hdl.handle.net/10316/104483http://hdl.handle.net/10316/104483TID:203161262engSousa, Vanessa Ferreira deinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-01-13T21:49:47Zoai:estudogeral.uc.pt:10316/104483Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:21:11.535362Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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