Exploiting RKIP protein as a novel predictor of EGFR targeted therapies response in lung cancer

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Cunha, Ana Raquel Ferreira
Data de Publicação: 2019
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/1822/81839
Resumo: Dissertação de mestrado em Ciências da Saúde
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spelling Exploiting RKIP protein as a novel predictor of EGFR targeted therapies response in lung cancerA proteína RKIP como um novo preditor de resposta a terapias moleculares dirigidas em cancro do pulmãoBiomarcador preditivoCancro do pulmãoPrognósticoRKIPTerapia em cancroCancer therapyLung cancerPredictive biomarkerPrognosisCiências Médicas::Ciências da SaúdeDissertação de mestrado em Ciências da SaúdeO cancro do pulmão (CP) é um dos mais fatais em todo o mundo, com uma expectativa de sobrevivência que raramente atinge os cinco anos. As terapias moleculares dirigidas têm revolucionado o tratamento do CP, sendo os inibidores do recetor do fator de crescimento epidermal (EGFR) os mais promissores e eficazes. Contudo, os pacientes tendem com o tempo a desenvolver resistência aos fármacos, daí ser necessário explorar novos preditores de resposta e mecanismos de resistência para estas terapias. Neste sentido, surge a proteína inibidora da cinase Raf (RKIP), uma reguladora importante de vias de sinalização celular, como a via de sinalização MAPK. Sendo considerada uma supressora de metástases, a subexpressão da RKIP tem sido associada a mau prognóstico em vários tipos tumorais, incluindo o CP. Neste trabalho, pretendeu-se primeiramente determinar o papel da RKIP na tumorigénese e outcome clinico de CP e, de seguida, explorar o papel da sua subexpressão na modulação da resposta a terapias anti-EGFR. Assim, uma revisão completa da literatura sobre RKIP em CP foi elaborada e análises in silico, usando a base de dados do TCGA, foram também realizadas tanto para validação da literatura quanto para validação dos nossos próprios resultados. A seguir, o knockout de RKIP foi realizado pela tecnologia CRISPR/Cas9 em quatro linhas celulares CP, e a influência da sua perda de expressão foi avaliada tanto a nível biológico como de resposta a inibidores de EGFR, recorrendo a ensaios in vitro (migração, viabilidade e clonogenicidade) e in vivo (CAM e xenotransplantes subcutâneos em ratinhos). Adicionalmente, o western blot foi a técnica escolhida para avaliar sempre que necessário a expressão e/ou ativação da RKIP e seus alvos, bem como das vias de sinalização celular. De forma geral, conseguimos demonstrar que a perda da RKIP está associada com maior agressividade em CP, aumentando a migração e viabilidade celular, e, mais importante, validamos in vivo que células sem RKIP têm uma capacidade aumentada de formar tumores. Por outro lado, identificámos que a linha celular PC9, que é mutante para EGFR, quando knocked out para RKIP, se torna menos responsiva a inibidores de EGFR (in vitro e in vivo), e também que essa resistência aparente pode ser devida à modulação da via de sinalização AKT. Tendo em consideração a “assinatura molecular” associada à RKIP que determinamos por análise in silico, seria de maior interesse no futuro explorar ainda outras vias identificadas que possam estar por detrás do ganho de resistência observado aos inibidores de EGFR em CP. Assim, os resultados sugeriram que a RKIP é potencialmente uma preditora negativa da resposta a terapias direcionadas ao EGFR em CP, particularmente em pacientes mutantes para EGFR.Lung cancer (LC) is one of the fatal cancers in the world with a life expectancy that rarely reach five years. Molecular targeted therapies have revolutionized LC treatment, with EGFR inhibitors outstanding. Unfortunately, patients end up developing drug resistance, hence, it is essential to discover novel response predictors as well as mechanisms of resistance. In this sense, Raf kinase inhibitory protein (RKIP) arises, as it is an important regulator of relevant intracellular pathways, such as MAPK signalling. Considered to be a metastasis suppressor, RKIP downregulation was associated with tumour malignancy and poor prognosis, in several tumour types, including LC. Herein, it was first aimed to explore the RKIP role in LC clinical outcome and tumorigenesis, and secondly to dissect its implication in the modulation of tumour cells response to anti-EGFR therapies. Thus, a complete review of the literature regarding RKIP in LC was written and, using the TCGA database, in silico analysis were also done both for validation of the literature and validation of our own results. Following, RKIP knockout was performed by CRISPR/Cas9 technology in four LC cell lines, and the influence of RKIP’s expression loss was evaluated at biological and EGFR inhibitors response levels, by in vitro (migration, viability and clonogenecity) and in vivo assays (CAM and subcutaneous xenograft mouse model). Additionally, western blot was the technique of choice to assess always that necessary the expression and/or activation of RKIP and its targets as well as of the signalling pathways. In general, we were able to demonstrate that RKIP loss is implicated in tumorigenic processes in LC, such as higher migration and viability capacity, and importantly, we validate in vivo that cells without RKIP have a higher capacity to form tumours. On the other hand, we found that PC9 cell line, which is EGFR mutant, upon RKIP KO, became less responsive to EGFR inhibitors (in vitro and in vivo), and also that this apparently resistance might be due the RKIP modulation of AKT signalling pathway. Having in consideration the molecular signature of RKIP that we determined by in silico analysis, it would be of upmost interest in the future to further explore other pathways identified that can be behind the observed gain of resistance to EGFR inhibitors in LC. Thus, our results suggested RKIP as a potential protein to be further explored as a novel negative predictor of EGFR targeted therapies response in LC, particularly in EGFR mutant patients.O financiamento para a realização deste projeto provém dos fundos do Programa Operacional Regional do Norte (NORTE 2020), sobre o Acordo de Parceria PORTUGAL 2020, através do Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER), que por sua vez advém do Programa Operacional Fatores de Competitividade — COMPETE, e dos fundos nacionais através da Fundação para a Ciência e Tecnologia sobre POCI-01-0145-FEDER-007038; e sobre o projeto NORTE-01-0145-FEDER-000013.Martinho, OlgaUniversidade do MinhoCunha, Ana Raquel Ferreira2019-07-232019-07-23T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttps://hdl.handle.net/1822/81839eng202441580info:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-07-21T12:40:15Zoai:repositorium.sdum.uminho.pt:1822/81839Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T19:37:01.266509Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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