Biological relevance of VUS identified in ATM gene and the role in DNA damage response

• Autor(a) principal: Vale, Ana Matilde Augusto
• Data de Publicação: 2022
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: eng
• Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10362/137427
• topic: ATM; Cancro de mama; CRISPR-Cas9; Variantes de Significado Desconhecidos; Vias de reparação do DNA; ATM; Breast Cancer; CRISPR-Cas9; DNA Damage Response; Variants of Unknown Significance.; Ciências Médicas

RESUMO: O cancro da mama hereditário é frequentemente associado a genes relacionados com as vias de reparação do DNA, em particular com a reparação dirigida por homologia (HR), a principal via de reparação de quebras duplas de DNA (DSB). Um dos iniciadores precoces desta via é o ATM, uma cinase que sinaliza as DSB e ativa uma cascata de sinalização que leva a duas respostas: paragem do ciclo celular e iniciação da reparação do DNA. Mutações no gene ATM têm sido associadas ao aparecimento de cancro da mama. Portanto, este gene faz parte dos painéis de genes utilizados nos testes genéticos para avaliar o risco de cancro da mama. Uma correta avaliação de risco é crucial para a prevenção do cancro e cuidados médicos adequados. Porém, com o aumento do uso de testes genéticos veio o aumento na deteção de Variantes de Significado Desconhecido (VUS). Perceber o impacto destas variantes é necessário para o paciente compreender o risco e fazer escolhas de prevenção. O nosso objetivo passava por introduzir duas variantes do ATM: uma variante provavelmente patogénica (ATM PAT), descoberta em duas irmãs gémeas com cancro de mama, e uma VUS (ATM VUS) escolhida a partir da base de dados ClinVar. Para atingir este objetivo, pretendíamos estabelecer modelos in vitro destas variantes, utilizando linhas tumorais e não tumorais de mama (MCF-7 e MCF10-A, respetivamente) utilizando o sistema CRISPR-Cas9. Apenas conseguimos estabelecer com sucesso um modelo heterozigota da variante provavelmente patogénica (MCF 7 PAT). Este clone demonstrou uma diminuição de 94% na expressão do ATM comparada com a linha MCF-7 normal. Na análise do ciclo celular, observámos uma disrupção na paragem da fase S. No entanto, os níveis de danos ao DNA medidos através do ɣ-H2AX eram semelhantes nas células com e sem a variante. No ensaio da Anexina V, os resultados não são claros, não sendo possível estabelecer uma relação entre a variante e a morte células. Mais ensaios funcionais deverão ser feitos para perceber melhor o impacto desta variante na resposta aos danos ao DNA.