Impact of superoxide dismutase mimics in nonsmall cell lung cancer cells in vitro

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Soares, Rita Barbosa Pacheco
Data de Publicação: 2022
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/63171
Resumo: Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, 2022, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.
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spelling Impact of superoxide dismutase mimics in nonsmall cell lung cancer cells in vitroNon-small cell lung cancerSOD mimicMnTnHexMnBuOEMetabolomicsCisplatinAntioxidant enzymesCytotoxicityTeses de mestrado - 2022Ciências da SaúdeTese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, 2022, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.O cancro do pulmão continua a ser a principal causa de mortes relacionadas com cancro em ambos os sexos, sendo o cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) o subtipo mais comum. Este subtipo de cancro é normalmente diagnosticado nos estádios mais avançados tendo, consequentemente, uma baixa taxa de sobrevida. Neste tipo de cancro o tratamento mais comum consiste na quimioterapia baseada em fármacos de cisplatina. No entanto, apesar do seu uso generalizado, a cisplatina possui diversos efeitos adversos (AE), entre os quais, a nefrotoxicidade. Para além disso, a resistência que as células malignas tendem a desenvolver a este tipo de fármaco é uma das suas principais limitações no seu sucesso clínico. O stress oxidativo está presente em diversas patologias, incluindo no cancro. As células cancerosas muitas vezes possuem níveis mais elevados de espécies reativas de oxigénio (ROS) do que as células saudáveis. Além disso, as células malignas possuem, de um modo geral, níveis mais baixos de enzimas responsáveis por destoxificar as ROS quando comparadas com células saudáveis, sendo que, em alguns casos estes sistemas podem mesmo encontrar-se inativados. Estas evidências incentivaram o uso de compostos miméticos das superóxido dismutases (SODm), no contexto da terapia do cancro. Estes são compostos sintéticos capazes de mimetizar as propriedades da SOD nativa, dismutando o radical anião superóxido em peróxido de hidrogénio (H2O2) e oxigénio. Esta sua capacidade leva a que esteja envolvido em diversas vias de sinalização, afetando a proliferação, diferenciação e morte celular. O modo de ação dos SODm determina um aumento adicional de H2O2 intracelular que, consequentemente, poderá ser incrementado até valores superiores ao limite a partir da qual a toxicidade se torna evidente, induzindo assim uma redução da proliferação celular e um aumento da eficácia da quimio/radioterapia. Além disso, estes compostos são capazes de proteger as células saudáveis dos AE da quimio/radioterapia. Existem diversas classes de SODm, sendo as porfirinas de manganês(III) (MnPs) as mais estudadas. Nos últimos anos, as MnPs MnTnHex e MnBuOE, consideradas muito promissoras, têm sido particularmente estudadas devido à sua eficácia, biodisponibilidade e farmacocinética. O composto MnTnHex já foi estudado em diversos tipos de cancro, entre eles, cancro renal, cancro da mama e glioblastoma, onde foi demonstrado que é capaz de reduzir a viabilidade e migração das células cancerosas. Para além disso, o MnTnHex também já demonstrou ter um efeito protetor em células saudáveis, não mostrando também, de acordo com trabalhos anteriores do nosso grupo, citotoxicidade em linhas celulares não-malignas (células V79 e Vero). MnBuOE é um composto derivado do MnTnHex, sendo considerada como a mais recente e bem sucedida MnP. Semelhante ao MnTnHex, o MnBuOE consegue ultrapassar a barreira hematoencefálica, tendo sido, até à data, bastante utilizado em diversos estudos relacionados com o cérebro. Estes estudos demonstraram que o MnBuOE é capaz de melhorar a memória e manter o comprimento dendrítico de ratinhos expostos a quimioterapia. No cancro da cabeça e pescoço, o MnBuOE foi capaz de aumentar a janela terapêutica da radioterapia. Atualmente, este composto encontra-se em diversos ensaios clínicos em fase I e II, devido ao seu papel como radioprotetor, estando a ser testado em metástases no cérebro, cancro da cabeça e pescoço e cancro anal. Neste contexto, o principal objetivo deste projeto inovador foi aferir o efeito destas duas MnPs, tanto isoladamente como combinadas com cisplatina em duas linhas celulares de NSCLC (A549 e H1975). Foram realizados diversos ensaios celulares, entre os quais, ensaios de viabilidade, migração, distribuição do ciclo celular, invasão e análise do exometaboloma. Estas duas linhas celulares foram também caracterizadas relativamente aos seus níveis basais de catalase, glutationa peroxidase 1 (GPX1) e peroxirredoxinas 1 (PRDX1) e 2 (PRDX2). Em primeiro lugar, ambas as linhas celulares demonstraram níveis baixos de expressão, particularmente da catalase, mas também da GPX1 e PRDX2. A PRDX1 revelou ter a maior expressão de RNAm, sendo duas vezes mais elevada nas células A549 do que nas células H1975. Contudo, esta diferença não foi significativa. O perfil citotóxico de ambas MnPs foi determinado através do ensaio de cristal violeta (CV) e MTS. As células foram expostas durante 72 h a MnTnHex (0,5-25 μM ). O MnTnHex demonstrou ser bastante citotóxico para as células, possuindo valores de IC50 muito baixos, variando entre 0,7 e 2,1 μM. O perfil citotóxico do MnBuOE também foi determinado através do CV e MTS (0,5-200 μM). Este composto demonstrou ser bastante menos citotóxico que o MnTnHex, diminuindo a viabilidade celular destas células para cerca 50% apenas para concentrações superiores 100 μM. É também importante referir que as células H1975 mostraram ser mais sensíveis a ambos os compostos que as células A549. Para determinar se estes compostos poderiam potenciar o efeito da quimioterapia baseada em fármacos de platina, procedeu-se ao co-tratamento das MnPs com cisplatina durante 72 h, seguido da avaliação da citotoxicidade através do ensaio do CV. No caso do MnTnHex utilizou-se duas concentrações, i.e. 0,5 e 1 μM, representativas de níveis diferentes de citotoxicidade. Estas concentrações foram iguais para ambas as linhas celulares. Para a cisplatina utilizou-se a concentração de 1 μM, em ambas as linhas, e 2 e 5 μM nas células A549 e H1975, respetivamente. O MnTnHex potenciou o efeito da cisplatina em todas as condições testadas, observando-se um maior efeito nas células H1975. Relativamente ao MnBuOE, foram testadas também duas concentrações (10 e 20 μM), sendo que as concentrações de cisplatina foram as mesmas. Neste caso, o MnBuOE potenciou significativamente o efeito da cisplatina nas células H1975. Contudo, nas células A549, observou-se apenas uma redução marginal da viabilidade sem significado estatístico. De modo a analisar o efeito destas MnPs, isoladamente ou combinadas com cisplatina, em endpoints associados à metastização, foram realizados ensaios de migração coletiva. Primeiramente, escolheram-se concentrações não citotóxicas, tanto das MnPs como da cisplatina, usando o ensaio do MTS. Foram selecionadas as concentrações de 5 μM de MnTnHex e 0,5 μM de cisplatina para as células A549 e as concentrações de 0,5 μM e 1 μM de MnTnHex e cisplatina para as células H1975, respetivamente. No caso do MnBuOE selecionou-se as concentrações de 5 e 10 μM para as células A549 e a concentração de 5 μM para as células H1975. Após a seleção das concentrações não citotóxicas procedeu-se à realização do ensaio de migração coletiva (32 h). Neste ensaio, o MnBuOE (per se ou combinado com a cisplatina) demonstrou possuir uma maior redução da migração coletiva em comparação com o MnTnHex. Adicionalmente foi também avaliado o impacto do MnTnHex sozinho ou combinado com cisplatina a nível da distribuição do ciclo celular. Utilizando as mesmas concentrações que nos ensaios combinatórios, observou-se um aumento da percentagem da população sub-G1 de ambas as células quando expostas ao MnTnHex (1 μM). Este aumento foi acentuado quando o MnTnHex foi combinado com a cisplatina. É de realçar que nas células A549 houve ainda um aumento da fase G2/M acompanhado por uma redução na fase G0/G1 quando o MnTnHex e a cisplatina foram adicionados simultaneamente. Ao analisar o exometaboloma das células cancerosas expostas ao MnTnHex sozinho ou combinado com cisplatina, detetou-se um aumento dos níveis de alguns compostos carbonílicos voláteis (VCCs), especificamente isobutanal, benzaldeido e 3- metilpentanal, os quais estão associados a stress oxidativo. Apesar destes VCCs só terem sido detetados, com significado estatístico, nas células H1975 quando expostas à concentração mais elevada de MnTnHex (per se ou combinado com cisplatina), foi possível observar um aumento dos níveis de isobutanal e benzaldeido nas células A549, ainda que sem significado estatístico. Por fim, analisou-se o efeito do MnBuOE na migração individual e na invasão realizando-se ensaios de quimiotaxia transwell e quimioinvasão transwell, respetivamente, utilizando as mesmas concentrações que nos ensaios da migração coletiva. O MnBuOE isoladamente reduziu significativamente a migração individual em ambas as células. No entanto, quando esta MnP foi combinada com a cisplatina levou a uma redução da migração individual das células A549 em mais de 50%, observando-se um valor semelhante nas células H1975. Na invasão, a combinação mais eficiente nas células H1975 foi observada no tratamento com MnBuOE per se, pois induziu uma redução na invasão de 34% (p<0,001). Contudo, quando combinado com cisplatina foi também possível observar uma redução de 18% (p<0,05). Em conclusão, os resultados obtidos no âmbito deste trabalho sugerem que ambas as MnPs são compostos promissores para serem considerados no tratamento do NSCLC, tanto em monoterapia como em combinação com a cisplatina, uma vez que poderão permitir o uso de doses mais baixas deste fármaco citotóxico, de modo a aumentar a sua eficácia e reduzir os AE associados. No entanto, é ainda necessário realizar estudos adicionais para melhor compreender, a nível molecular, o modo de ação destes compostos.Lung cancer (LC) continues to be the leading cause of cancer-related deaths for both genders combined, being non-small cell lung cancer (NSCLC) the most common subtype. NSCLC is commonly diagnosed in advanced stages and thus has a low survival rate. For these cases, one of the current standard treatments is cisplatin-based chemotherapy. Despite being widely used, cisplatin has several adverse effects associated, being resistance to the treatment also a major limitation to its clinical success. Oxidative stress is present in several pathologies, including cancer. Malignant cells have often been demonstrated to possess higher reactive oxygen species (ROS) levels than healthy cells. In addition, the main antioxidant enzymes responsible for the detoxification of hydrogen peroxide are usually present in lower levels or inactivated in malignant cells when compared to healthy cells. These findings encouraged the usefulness of superoxide dismutase mimics (SODm) in the context of cancer therapy. SODm are synthetic compounds with the ability to mimic the properties of native SOD enzymes, by dismutating the superoxide anion, being also considered modulators in different redox pathways. Among the different classes of SODm, the manganese(III) porphyrins (MnPs), particularly MnTnHex and MnBuOE are very promising compounds, with several applications. In this context, the aim of the innovative work herein developed was to assess the effects of these two MnPs alone and combined with cisplatin in two NSCLC cell lines (A549 and H1975). Several endpoints were performed, including cell viability, migration, cell cycle distribution, invasion, and the analysis of the exometabolome. Also, both cell lines were initially characterized in terms of innate expression levels of catalase, glutathione peroxidase 1 (GPX1), and peroxiredoxins 1 (PRDX1) and 2 (PRDX2). Both cell lines displayed low expression levels in particular for catalase, but also GPX1 and PRDX2. PRDX1 was the enzyme with the higher mRNA expression levels. Both compounds displayed cytotoxic features in these cell lines, with MnTnHex showing very low IC50 values ranging from 0.7 and 2.1 μM, while MnBuOE only decreased the viability of these cells to approximately 50% for concentrations above 100 μM. When combined with cisplatin, MnTnHex was able to enhance the cytotoxicity of cisplatin in A549 and H1975 cells. In turn, MnBuOE did not potentiate the effect of cisplatin in A549 cells, although significantly enhanced the cytotoxicity of cisplatin in H1975 cells. This cell line was more sensitive to both MnPs, either alone or combined with cisplatin. Regarding collective cell migration, MnBuOE caused a higher impairment, reducing cell migration up to more than 40%, whereas MnTnHex led to a reduction of collective migration up to 30%. Moreover, MnTnHex per se or combined with cisplatin altered the cell cycle distribution, inducing cell cycle arrest. Metabolomics revealed an increase in the levels of a few carbonyl compounds associated with oxidative stress in cells treated with MnTnHex alone or combined with cisplatin. MnBuOE was able to reduce chemotactic migration and invasion either per se or upon co-treatment with cisplatin. Overall, these results suggest that these MnPs are considered promising drug candidates for NSCLC, which might be valuable in combination with cisplatin, allowing lower doses of this drug towards an improved efficacy.Research Institute for Medicines, Faculty of Pharmacy, University of Lisbon; Universidade Lúsofona´s Research CBIOS; UCIBIO, REQUIMTE, Laboratory of Toxicology, Faculty of Pharmacy, University of PortoOliveira, Nuno Filipe da Rocha Guerreiro dePinho, Paula Guedes deRepositório da Universidade de LisboaSoares, Rita Barbosa Pacheco2022-11-222022-10-282025-11-22T00:00:00Z2022-11-22T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/63171TID:203199014enginfo:eu-repo/semantics/embargoedAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2024-03-11T01:18:50Zoai:repositorio.ul.pt:10451/63171Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-20T03:14:23.684384Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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