Evaluation of next generation sequency protocols for VIH complete genome sequencing

• Autor(a) principal: TROVÃO, Nídia Isabel Sequeira
• Data de Publicação: 2011
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: deu
• Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10362/51111
• topic: Ciências biomédicas; Biologia molecular; Parasitologia médica; Sida; Domínio/Área Científica::Ciências Médicas

Vírus da imunodeficiência humana (VIH) é um retrovírus que deu origem a uma pandemia após transmissão zoonótica na primeira metade do século XX. A terapia actual, conhecida como terapia anti-retroviral altamente activa, pode retardar significativamente a progressão da doença. No entanto, apesar de mais de 25 anos de intensa investigação ainda não existe cura disponível. Todos os fármacos anti-retrovirais disponíveis são confrontados com o desafio colocado pelo alto potencial evolutivo do VIH. Isto implica que, independentemente do coquetel de fármacos administrados, resistência aos mesmos pode e vai desenvolver-se. Para gerir esses efeitos negativos, os pacientes devem ser vigiados regularmente, a fim de detectar o desenvolvimento de resistência a fármacos precocemente, de modo a que se possa ajustar oportunamente o regime terapêutico. É de notar que tanto as estirpes resistentes, que evoluíram de novo ou foram adquiridas por meio de transmissão, podem ter impacto negativo no resultado da terapia. Assim sendo, também os pacientes nunca sujeitos a terapia devem ser avaliados antes do início da mesma. Essa triagem geralmente envolve genotipagem da população viral através do sequenciamento directo dos produtos de RT-PCR. Infelizmente, essa abordagem não permite a detecção fiável de estirpes virais presentes em menos de 20% a 25% da população. A associação entre populações minoritárias codificantes de resistência a fármacos com a falha terapêutica, impulsionou as investigações para explorar a plataforma da Roche® 454, como tentativa de ganhar conhecimento mais preciso e em profundidade da população viral. Contudo, tais estudos estão limitados a determinadas regiões genómicas e por outro lado os procedimentos aplicados para fragmentação na plataforma da Roche® 454 requerem elevada quantidade de material primário. Esta tese impõe-se como parte de um projecto mais amplo, comparando os mais recentes protocolos de pré-processamento de amostras para sequenciação completa do genoma de VIH, proveniente de amostras clinicas de plasma e células mononucleares do sangue periférico, e identificação do reservatório mais adequado para detecção de resistência em pacientes recentemente infectados, como segundo objectivo. Assim sendo, este trabalho de investigação foca-se nos aspectos práticos correspondentes ao pré-processamento de amostras antes da geração de dados de sequência. Em detalhe, todos os procedimentos de laboratório, tanto para a estratégia de amplificação de sequência específica e de sequência aleatória foram realizadas. Para o primeiro, geramos 6 amplicões que se sobrepõem para cobrir o genoma inteiro do VIH-1. Depois de misturamos equimolarmente todos os amplicões para cada amostra, foram realizados dois métodos fragmentação enzimática. Estes serão comparados com o método convencional mecânico de fragmentação empregue pela Roche® 454. O sequenciamento com êxito de uma amostra e a conclusão de todos os procedimentos de pré-processamento são promissores para outras aplicações, mas uma avaliação abrangente dos dados de sequenciação a serem gerados é necessário fazer uma escolha informada entre as diferentes abordagens.