Constant-pH MD simulations of higher complexity lipid bilayer models: PA/PC binary mixtures
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| Data de Publicação: | 2013 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | eng |
| Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10451/10087 |
Resumo: | Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2013 |
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Constant-pH MD simulations of higher complexity lipid bilayer models: PA/PC binary mixturesÁcido fosfatídicopHProtonaçãoIõesForça iónicaDinâmica molecular a pH constanteInteracções electrostáticasTransições de faseTeses de mestrado - 2013Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2013As membranas biológicas são estruturas ubíquas altamente flexíveis cuja formação é, do ponto de vista termodinâmico, espontânea. Estas estão envolvidas em inúmeros processos moleculares essenciais para a célula desde o tráfego e sinalização intracelulares até ao equilíbrio vida {morte da própria célula. Fundamentalmente, estas entidades macromoleculares são características de todos os seres vivos, sendo uma das principais distinções entre estes e os seres inanimados. Em suma, a existência de membranas biológicas é crucial para a manutenção da Vida, tal como a conhecemos. As bicamadas fosfolipídicas constituem o elemento estrutural primário das membranas biológicas, sendo que os principais componentes estruturais das bicamadas lipídicas são os lípidos, designadamente, os fosfolípidos. Durante vários anos os componentes lipídicos das membranas biológicas foram considerados simplesmente como elementos estruturais (\espectadores passivos" do ponto de vista funcional) sendo que a própria funcionalidade da membrana se centrava fundamentalmente em torno do seu papel estrutural e de suporte. Mais recentemente, quer com o aparecimento de novas questões relacionadas com a elevada diversidade estrutural de lípidos e possível correlação com propriedades funcionais específicas, quer com o aparecimento de resultados experimentais que apontam para um papel extremamente activo da membrana biológica e dos seus componentes nos mais variados aspectos fisiológicos, esta ideia tem sido desafiada, caindo mesmo em desuso. Apesar do crescente interesse observado na elucidação do papel da membrana biológica na célula, ainda muito pouco se sabe sobre as bases bioquímicas e biofísicas subjacentes aos mais variados processos biológicos. Paradoxalmente, as metodologias experimentais disponíveis não conseguiram ainda acompanhar as necessidades actuais, sendo ainda limitadas em termos da resolução espacial e temporal de que dispõem. Assim, o conhecimento é baseado em princípios e modelos qualitativos que padecem de uma exatidão aquém do pretendido, estando geralmente associados a bases fenomológicas fundamentalmente hipotéticas, o que torna este tipo de conhecimento bastante limitado. Conceitos básicos como a influência do pH sobre a estrutura e a funcionalidade das membranas biológicas são ainda rudimentares, e muitas outras questões, relacionadas com a arquitetura e a fenomologia da membrana celular enquanto entidade estrutural e funcional, continuam por revelar. A título de exemplo, as interações entre pequenos péptidos ou proteínas, membranares ou solúveis, com os componentes lipídicos das membranas biológicas, é hoje em dia uma das questões mais amplamente estudadas. Apesar de tudo, uma vez mais, se reforça a inexistência de modelos membranares capazes de elucidar sobre o papel e o mecanismo destas interacções para a célula, de uma forma eficiente e ao mesmo tempo _dedigna. Um dos pontos-chave que precisam urgentemente de ser clarificados passa pelo corroborar da existência de microdomínios especializados de membrana, passíveis de serem funcionais, que se pensa estar implicados nos mecanismos de estabelecimento de interacções do tipo acima supracitadas. Tendo em conta que a compreensão de muitas destas problemáticas passa numa fase inicial por revelar o papel biofísico destas entidades biológicas, a um nível de detalhe molecular suficiente a uma melhor integração de muito do conhecimento que já existe, com este trabalho propomo-nos a estudar de uma forma integrativa a hipótese de que lípidos aniónicos, nomeadamente, o ácido fosfático (PA) pode desempenhar um papel de \pH-biosensing" ao nível da célula. Postula-se que este lípido esteja implicado como um elo de ligação entre o metabolismo lipídico e a disponibilidade de nutrientes, nomeadamente de glucose, no meio ambiente. O grupo experimental de Loewen et al conseguiu isolar o PA como o agente participativo no reconhecimento membranar ao nível do retículo endoplasmático (ER) de uma proteína solúvel, a Opi1, sendo que o estabelecimento e manutenção da interacção entre ambos é intrinsecamente dependente do valor de pH do meio. Sendo o PA um fosfomonoéster, tem três diferentes estados de carga (PA0, PA-1 e PA-2), estados estes que estão em constante equilíbrio a um valor de pH perto do fisiológico. Tendo isto em conta e sabendo que o valor do segundo pKa é cerca de 7 unidades de pH, pensa-se que este lípido pode actuar como um biosensor de pH, ao alterar dramaticamente a sua carga de acordo com pequenas mas rápidas variações do pH intracelular. Assim para valores de pH ligeiramente acídicos, abaixo das 6 unidades de pH, a interacção é suficientemente enfraquecida o que promove a libertação da Opi1 para o citosol e deslocamento desta para o núcleo onde surtirá efeitos regulatórios ao nível de genes implicados no metabolismo geral, nomeadamente no metabolismo dos lípidos, inclusivamente do próprio PA. Mesmo sendo bem conhecido (apesar de postulado) o mecanismo subjacente a este fenómeno, pouco se sabe, com rigor, sobre a influência da própria interacção PA{Opi1 no valor do pKa deste lípido e sobre a real influência das interacções electroestáticas e respectiva dependência com o valor de pH do meio. Assim, um dos principais objectivos deste trabalho passou por clarificar quantitativamente a protonação deste lípido aniónico aquando presente numa mistura binária de dois lípidos - DMPA e DMPC. Este é um modelo mais realista da membrana biológica do RE, organelo onde o PA é na verdade um dos mais prevalentes lípidos aniónicos. Na verdade, as interacções electroestáticas são actualmente tidas em conta como tendo um impacto bastante pronunciado na estrutura e na dinâmica das membranas biológicas. Este facto justifica o porquê do pH ter um papel tão crucial nas propriedades estruturais das membranas que contêm lípidos aniónicos. Para além do pH, a força iónica pode também ter um forte efeito em bicamadas lipídicas carregadas. Apesar de clara a necessidade de reproduzir o mais biológica e fidedignamente a quantidade e a distribuição de contra-iões que se encontram a solvatar a membrana, a verdade é que este é comummente ignorado. Posto isto, apresentamos neste trabalho uma nova aproximação para estimar a quantidade correta de contra-i~oes que devem ser adicionados a um sistema numa simulação de MD típica. Através da aplicação de uma metodologia baseada no formalismo de PB para estimar a quantidade “correcta" de iões Na+ e Cl- presentes em solução e através da aplicação de um tratamento eletrostático adequado (GRF a 0.1 M de força iónica), obtivemos bicamadas lipídicas estáveis e reprodutíveis aos vários valores de pH testados. Adicionalmente, fomos também capazes de reportar a transição de fase isotérmica anteriormente reportada. De acordo com Garidel et al, para uma bicamada fosfolípida composta pela mistura binária de PA/PC, a uma fracção molar semelhante à por nós estudada (25 % PA/PC), espera-se que esta apresente uma coexistência de ambas as fases gel (organizada) e líquida-cristalina (desorganizada), a um valor de pH rondando as 4 unidades de pH. Já aos valores de pH - 7 e pH - 12, espera-se que esta se apresente integralmente na fase fluida ( L α ). Tendo em conta que os resultados obtidos neste trabalho estão bastante concordantes com aqueles reportados na literatura, conseguimos assim a validação do nosso modelo. De salientar que presentemente estão a ser realizados estudos de uma mesma natureza em modelos de membranas biológicas contendo outras fracções molares de PA/PC, designadamente 50% e 100%, de forma a melhor compreender o efeito deste factor nas várias propriedades estruturais e dinâmicas estudadas. Com esta tese obtivemos resultados promissores que consideramos ser essenciais para o prosseguimento desta linha de trabalho no sentido de elucidar o papel do lípido aniónico PA no estabelecimento de interacções dependentes do pH com a Opi1. Sabendo que as interacções entre o PA e a Opi1 são conduzidas pela eletrostática do sistema e portanto dependentes do pH da solução, a nossa metodologia poderá vir a ser uma das mais capazes em modelar e confirmar a existência de uma interacção significativa PA{Opi1 a determinados valores de pH. Adicionalmente, depois de completa e devidamente validadas as metodologias aplicadas no decorrer deste trabalho, pretendemos amplificar o nosso estudo a outros fosfomonoestéres que se pensa estarem implicados também em funções de reconhecimento e sinalização celulares, como é o caso dos fosfoinositídeos (PIPs) - PtdIns(4)P e PtdIns(4,5)P2. A longo termo, este trabalho abriu ainda a possibilidade de proceder ao estudo de fenomologias como é o caso da segregação lateral de diferentes componentes lipídicos e consequente formação e manutenção de microdomínios especializados.Biological membranes fulfill a central role on a vast array of molecular processes, most of them crucial for cell viability. These entities may contain up to 30% ionizable lipids, which results in pH having a major impact on the structure and dynamics of membranes. In certain organelles, phosphatidic acid (PA) is the major anionic lipid. Being a phosphomonoester, PA has three different charge states (PA0, PA1 and PA2) that are interchanging at physiological pH. After obtaining a titration curve for a 25% PA/PC binary mixture, we computed the pKa1 _ 2.5 and pKa2 _ 7.0, which illustrate that, at physiological conditions, this lipid can act as a \pH biosensor" by effectively changing its charge upon small intracellular pH variations. We observed that (de)protonation induces drastic changes in the membrane conformation with adjustment of its lateral packing. In fact, it has been shown that an isothermal phase transition is possible, when triggered electrostatically. According to Garidel et al, a bilayer composed of a binary mixture similar to the one simulated is expected to present a gel phase coexisting with a liquid-crystalline phase at pH 4. At around physiological and higher pH values, the bilayer should be in its pure fluid phase (L_). Our results are in very good agreement with the ones reported. In addition to pH, also the ionic strength can have a strong effect on charged lipid bilayers. Nevertheless, the problem regarding the number of counter-ions solvating membranes is usually overlooked. Here, we present a new approach to estimate the amount of counter-ions that should be added in a typical MD simulation. This methodology was validated with experimental data from DMPA/ DMPC phase transition, and compared with other commonly used approaches based on different treatments of the long-range electrostatics (GRF and PME).Machuqueiro, Miguel Ângelo dos SantosRepositório da Universidade de LisboaSantos, Hugo Alexandre Feiteira dos2014-01-15T16:08:16Z20132013-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/10087TID:201325845enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T15:55:05Zoai:repositorio.ul.pt:10451/10087Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:34:07.543521Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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