Novas abordagens no diagnóstico serológico da pneumocistose

• Autor(a) principal: TOMÁS, Ana Luísa Regatão
• Data de Publicação: 2014
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10362/19200
• topic: Ciências biomédicas; Pneumocystis jirovecii; Pneumonia; Diagnóstico clínico; Pneumologia; Domínio/Área Científica::Ciências Médicas

A pneumonia por Pneumocystis (PPc) é uma importante infeção respiratória em doentes imunocomprometidos. O seu diagnóstico é baseado na visualização microscópica de quistos ou formas tróficas coradas e/ou na deteção de DNA de Pneumocystis jirovecii por PCR, em espécimes pulmonares normalmente obtidas por técnicas invasivas. O desenvolvimento de um teste serológico fiável e reprodutível é uma necessidade premente, pois permitirá o diagnóstico da PPc com recurso a amostras obtidas de forma minimamente invasiva, como o sangue. Este estudo associou a síntese de um antigénio recombinante à técnica de ELISA (do inglês, Enzyme-linked immunosorbent assay) para deteção de anticorpos anti-P. jirovecii, procurando desenvolver uma nova abordagem laboratorial para o diagnóstico da PPc. O antigénio recombinante sintético multiepítopo foi selecionado, desenhado e produzido com base no estudo da imunogenicidade do domínio carboxilo-terminal da glicoproteína major de superfície (MsgC) de P. jirovecii. O gene sintético codificante do antigénio recombinante foi clonado no vetor de expressão pLATE 31, através da tecnologia de clonagem independente de ligase. Este vetor permitiu a produção do antigénio recombinante sintético multiepítopo com uma cauda de poli-histidina terminal, o que possibilitou a sua purificação por cromatografia de alta afinidade com iões níquel imobilizados e a sua utilização como ferramenta antigénica numa técnica de ELISA. Esta técnica foi otimizada para a pesquisa de anticorpos totais e das imunoglobulinas IgG e IgM anti-P. jirovecii. Foram estudados espécimes pulmonares e soros de 80 doentes imunocomprometidos, com suspeita de patologia pulmonar, e 17 soros de dadores de sangue (controlo). Os casos de PPc foram confirmados por imunofluorescência indireta com anticorpos monoclonais e por nested PCR. A informação clínica do diagnóstico presuntivo da PPc (sintomas, PaO2, exames radiológicos) estava disponível. Estatisticamente, os níveis de IgM anti-P. jirovecii estavam aumentados nos doentes com PPc (p = 0,003), o que levou à rejeição da hipótese nula de que a distribuição deste marcador seja idêntica entre doentes com e sem PPc. O teste ELISA com pesquisa de anticorpos totais e IgG anti-P. jirovecii não apresentaram resultados estatisticamente significativos (p > 0,005). A análise da curva ROC (do inglês, Receiver Operating Characteristic) do teste ELISA com pesquisa de IgM anti-P. jirovecii mostrou que o cut-off que apresentou melhores resultados se situava numa absorvância (Abs) de 0,300 a 405 nm, com uma sensibilidade de 97 % e uma especificidade de 75 % (p < 0,001), quando associado ao diagnóstico clínico para a PPc. Com esta abordagem inovadora, desenvolveu-se um novo método para deteção de P. jirovecii, sensível e específico quando associado ao diagnóstico clínico. Esta abordagem poderá funcionar como teste de rastreio da PPc, diminuindo a necessidade de se obter amostras por técnicas invasivas, o que será um grande benefício para o doente e uma melhoria no controlo clínico da doença.