The mechanism mediating nuclear translocation of the apoptosis inducing factor (AIF)

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Cunha, Rita Isabel Costa
Data de Publicação: 2012
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/1822/23450
Resumo: Dissertação de mestrado em Genética Molecular
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spelling The mechanism mediating nuclear translocation of the apoptosis inducing factor (AIF)576.3Dissertação de mestrado em Genética MolecularSince the discovery that yeast cells can undergo programmed cell death in response to several different stimuli, Saccharomyces cerevisiae has gained prominence in the cell death field. Exposure of yeast cells to certain stimuli like acetic acid or hydrogen peroxide or even heterologous expression of pro-apoptotic proteins can trigger cell death by apoptosis via a mitochondrial pathway and exhibiting the typical hallmarks of apoptosis, such as chromatin condensation, ROS (reactive oxygen species) accumulation, DNA fragmentation, externalization of phosphatidylserine, mitochondrial dysfunction with release of cytochrome c and of apoptosis inducing factor (Aif1p), among other pro-apoptotic proteins. Aif1p is a flavoprotein that is involved both in cell survival and cell death. In healthy cells, Aif1p is confined to the mitochondria, where it plays a role in bioenergetic and redox metabolism due to its redox activity and its FAD and NADH domains. However, when cells are exposed to an apoptotic stimulus, Aif1p is released from mitochondria to the cytosol and then translocated to the nucleus, where it will induce DNA fragmentation and chromatin condensation. Although the mechanism underlying this translocation is still poorly understood, it is known that transport into the nucleus through the nuclear pore complexes is an energydependent process for the majority of macromolecules, and normally mediated by the major class of transport receptors, the karyopherins or Kaps. In this work, we aimed elucidate the mechanism regulating yeast Aif1p import into the nucleus and to discover which Kap is responsible for the nuclear import of Aif1p. Apoptosis was triggered in cells expressing Aif1p tagged with GFP (by exposure to acetic acid or hydrogen peroxide, chronological ageing, or heterologous expression of Bax cmyc protein) and Aif1p localization was assessed by fluorescence microscopy and cellular fractionation/western blot assays. However, we were not able to observe the release of Aif1p to the cytosol or its nuclear import under our experimental conditions. We also attempted to map the NLS domain of Aif1p by deletion of several domains with homology to previously mapped domains in human AIF. Although we has not yet mapped the Aif1p NLS domain, we discovered that deletion of the putative Hsp70p-binding domain led to aberrant localization of Aif1p, suggesting that Hsp70p is important for Aif1p folding and stability. These results indicate that Hsp70p may also be involved in the regulation of Aif1p localization in yeast.Células de Saccharomyces cerevisiae são capazes de desencadear um processo de morte celular programada em resposta a vários estímulos. Esta descoberta levou à utilização extensiva deste organismo eucarionte unicelular como modelo no estudo de processos de morte celular. Sabe-se que a exposição de células de levedura a certos estímulos, como o ácido acético ou peróxido de hidrogénio, ou mesmo a expressão heteróloga de proteínas próapoptóticas de mamífero, pode desencadear um tipo morte celular dependente de uma via mitocondrial e exibindo características típicas da morte apoptótica, tais como a condensação da cromatina, acumulação de espécies reativas de oxigénio (ROS), fragmentação do DNA, externalização de fosfatidilserina e disfunção mitocondrial associada à libertação de citocromo c e do fator indutor de apoptose (Aif1p). Aif1p é uma flavoproteína que está envolvida tanto na sobrevivência como na morte celular. Em células saudáveis, esta proteína está confinada à mitocôndria, onde desempenha um importante papel no metabolismo bioenergético e estado redox. Este facto é devido à sua atividade redox e aos seus domínios FAD e NADH. No entanto, em células expostas a um estímulo apoptótico, ocorre libertação de Aif1p da mitocôndria para o citosol e subsequentemente a sua translocação para o núcleo, onde induz fragmentação do DNA e condensação da cromatina. Embora o mecanismo subjacente a esta translocação esteja ainda pouco conhecido e estudado, sabe-se que para a maioria das macromoléculas o transporte para o núcleo ocorre através dos complexos de poros nucleares e é um processo dependente de energia, normalmente mediado por uma classe de recetores de transporte, as Kaps (do inglês “karyopherins”, também conhecidas como importinas ou transportinas). Este trabalho teve como objectivo elucidar a regulação do mecanismo de transporte de Aif1p para o núcleo e identificar que/ais Kap(s) são responsáveis pelo importe do Aif1p para o núcleo na levedura. A morte celular apoptótica foi induzida em células que expressam uma fusão da proteína Aif1 com GFP (por exposição a ácido acético ou peróxido de hidrogénio, envelhecimento cronológico, ou pela expressão heteróloga de proteínas Bax c-myc) e a localização de Aif1p foi avaliada por microscopia de fluorescência e fracionamento celular /western Blot. No entanto, não fomos capazes de observar libertação de Aif1p para o citosol ou a sua importação nuclear nas condições experimentais utilizadas. Tentámos também mapear o domínio NLS de Aif1p através da remoção de vários domínios homólogos com domínios conhecidos de AIF humano. Embora não tenhamos ainda conseguido mapear o domínio NLS do Aif1p, descobrimos que a deficiência no domínio putativo de ligação a Hsp70 resulta numa localização aberrante de Aif1p, sugerindo que a Hsp70 é importante para a estabilidade desta proteína e que esta proteína pode ainda estar envolvida na regulação da localização de Aif1p na levedura.Côrte-Real, ManuelaChaves, S. R.Universidade do MinhoCunha, Rita Isabel Costa20122012-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/1822/23450enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-07-21T12:35:12Zoai:repositorium.sdum.uminho.pt:1822/23450Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T19:31:01.673668Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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