Clonagem e caracterização das isoformas de luciferases de lanternas e corpo gorduroso do vagalume Aspisoma lineatum (Lampyridae: Cratomorphini): origem estrutural e evolutiva das luciferases pH-sensitivas mais eficientes à partir de ancestrais pH-insensitivas
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Data de Publicação: | 2020 |
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Texto Completo: | https://repositorio.ufscar.br/handle/ufscar/14311 |
Resumo: | Firefly luciferases emit yellow-green light with high efficiency at physiological pH. However, under acidic conditions, in the presence of heavy metals or high temperatures, they emit red light. To understand the structural origin of the different colors of bioluminescence and the sensitivity to pH, more than 30 luciferases of fireflies have already been cloned, sequenced and characterized. Recently, the binding site for protons and metals in luciferases has been determined. However, how the efficient pH-sensitive luciferases of firefly lanterns emerged and evolved is not clear. Therefore, in this work, the cloning, characterization and comparison of the cDNAs of the isozymes of the luciferases of the lanterns and the fatty body of the firefly Aspisoma lineatum (Lampyrinae: Cratomorhini) was carried out in order to better understand the origin and evolution of the sensitivity to pH. The isoform AL2 from the fat body has 545 amino acids, extremely slow kinetics and an emission spectrum insensitive to pH variations. In contrast, the AL1 isoform found in the adult lantern has 548 amino acids, flash-type kinetics, pH-sensitive spectrum and a catalytic efficiency 10x greater than the AL2 isoform. Analysis of thermal stability and CD spectra showed that the pH-insensitive form is much more thermostable and rigid than the lanterns isoform and other firefly luciferases investigated so far. The position H310, which is involved in the pH sensitivity of firefly luciferases, is replaced by a glutamine in the lantern isoform and by glutamate in the fat body one, indicating that the substitution E310Q may be determinant for the origin of the phenotype pH-sensitive. These results indicate that the pH-sensitive luciferases, found in firefly lanterns, originated from a more rigid, pH-insensitive, less efficient ancestral luciferase. These results also show that the isoform AL2, due to its high thermostability, has potential for biotechnological applicability. |
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Carvalho, Mariele Cristina deViviani, Vadimhttp://lattes.cnpq.br/3942043373510668http://lattes.cnpq.br/830678177331857406268d96-cea2-4396-8b13-01c0fa934d872021-05-26T12:11:38Z2021-05-26T12:11:38Z2020-10-31CARVALHO, Mariele Cristina de. Clonagem e caracterização das isoformas de luciferases de lanternas e corpo gorduroso do vagalume Aspisoma lineatum (Lampyridae: Cratomorphini): origem estrutural e evolutiva das luciferases pH-sensitivas mais eficientes à partir de ancestrais pH-insensitivas. 2020. Tese (Doutorado em Genética Evolutiva e Biologia Molecular) – Universidade Federal de São Carlos, São Carlos, 2020. Disponível em: https://repositorio.ufscar.br/handle/ufscar/14311.https://repositorio.ufscar.br/handle/ufscar/14311Firefly luciferases emit yellow-green light with high efficiency at physiological pH. However, under acidic conditions, in the presence of heavy metals or high temperatures, they emit red light. To understand the structural origin of the different colors of bioluminescence and the sensitivity to pH, more than 30 luciferases of fireflies have already been cloned, sequenced and characterized. Recently, the binding site for protons and metals in luciferases has been determined. However, how the efficient pH-sensitive luciferases of firefly lanterns emerged and evolved is not clear. Therefore, in this work, the cloning, characterization and comparison of the cDNAs of the isozymes of the luciferases of the lanterns and the fatty body of the firefly Aspisoma lineatum (Lampyrinae: Cratomorhini) was carried out in order to better understand the origin and evolution of the sensitivity to pH. The isoform AL2 from the fat body has 545 amino acids, extremely slow kinetics and an emission spectrum insensitive to pH variations. In contrast, the AL1 isoform found in the adult lantern has 548 amino acids, flash-type kinetics, pH-sensitive spectrum and a catalytic efficiency 10x greater than the AL2 isoform. Analysis of thermal stability and CD spectra showed that the pH-insensitive form is much more thermostable and rigid than the lanterns isoform and other firefly luciferases investigated so far. The position H310, which is involved in the pH sensitivity of firefly luciferases, is replaced by a glutamine in the lantern isoform and by glutamate in the fat body one, indicating that the substitution E310Q may be determinant for the origin of the phenotype pH-sensitive. These results indicate that the pH-sensitive luciferases, found in firefly lanterns, originated from a more rigid, pH-insensitive, less efficient ancestral luciferase. These results also show that the isoform AL2, due to its high thermostability, has potential for biotechnological applicability.Luciferases de vagalumes emitem luz verde-amarela com alta eficiência em pH fisiológico. No entanto, sob condições ácidas, na presença de metais pesados ou altas temperaturas, elas emitem luz vermelha. Para entender a origem estrutural das diferentes cores de bioluminescência e da sensibilidade ao pH, mais de 30 luciferases de vagalumes já foram clonadas, sequenciadas e caracterizadas. Recentemente, o sítio de ligação para prótons e metais em luciferases foi identificado. Entretanto, como as atuais luciferases pH-sensitivas encontradas nas lanternas dos vagalumes se originaram e evoluíram ainda não está claro. Assim sendo, neste trabalho foi feita a clonagem, caracterização e comparação dos cDNAs das isozimas de luciferases das lanternas e corpo gorduroso do vagalume Aspisoma lineatum (Lampyrinae: Cratomorphini). A isoforma AL2 do corpo gorduroso possui 545 aminoácidos, apresenta uma cinética extremamente lenta e um espectro de emissão insensível à variações de pH. Em contraste, a isoforma AL1, encontrada na lanterna possui 548 aminoácidos, cinética rápida do tipo flash, espectro pH-sensível e uma eficiência catalítica 10 vezes maior que a isoforma AL2. Análises de estabilidade térmica e de CD mostraram que a AL2, além de ser pH-insensível, é muito mais termoestável e rígida do que a isoforma AL1 e outras luciferases de vagalumes investigadas até o momento. A posição 310, cujos resíduos estão envolvidos na sensibilidade ao pH, é substituída por uma glutamina na isoforma da lanterna AL1 e por glutamato na isoforma AL2 do corpo gorduroso, indicando que a substituição E310Q pode ter sido determinante na origem do fenótipo pH-sensível. Estes resultados demonstram que as luciferases pH-sensitivas, encontradas nas lanternas de vagalumes, se originaram por flexibilização estrutural à partir de uma luciferase ancestral mais rígida, pH-insensível, menos eficiente. Estes resultados também mostram que a isoforma AL2, devido à sua alta termoestabilidade, tem potencial para aplicabilidade biotecnológica em bioimagem.Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)2016/07312-62010/05426-8porUniversidade Federal de São CarlosCâmpus São CarlosPrograma de Pós-Graduação em Genética Evolutiva e Biologia Molecular - PPGGEvUFSCarAttribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Brazilhttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/br/info:eu-repo/semantics/openAccessBioluminescênciaLuciferasesSensibilidade ao pHAspisoma lineatumBioluminescenceLuciferasespH-sensitivityCIENCIAS BIOLOGICAS::BIOQUIMICAClonagem e caracterização das isoformas de luciferases de lanternas e corpo gorduroso do vagalume Aspisoma lineatum (Lampyridae: Cratomorphini): origem estrutural e evolutiva das luciferases pH-sensitivas mais eficientes à partir de ancestrais pH-insensitivasCloning and characterization of luciferase isoforms from lanterns and fat body of the firefly Aspisoma lineatum (Lampyridae: Cratomorphini): structural and evolutionary origin of most efficient pH-sensitive luciferases from pH-insensitive ancestorsinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesis60060031ed8a77-4308-4d3f-a8b7-f9d05c44b901reponame:Repositório Institucional da UFSCARinstname:Universidade Federal de São Carlos (UFSCAR)instacron:UFSCARORIGINALTESE Mariele Carvalho - Final_Banca_propgweb.pdfTESE Mariele Carvalho - Final_Banca_propgweb.pdfVersão final da tese após correções sugeridas pela banca de defesa.application/pdf3940551https://repositorio.ufscar.br/bitstream/ufscar/14311/4/TESE%20Mariele%20Carvalho%20-%20Final_Banca_propgweb.pdfb2af881eefd5922580f2489abc8952bfMD54Carta-comprovante Mariele.pdfCarta-comprovante Mariele.pdfcarta comprovando a autenticidade da versão finalapplication/pdf211979https://repositorio.ufscar.br/bitstream/ufscar/14311/2/Carta-comprovante%20Mariele.pdfd3326342641791b5b416ad50a63cef2bMD52CC-LICENSElicense_rdflicense_rdfapplication/rdf+xml; charset=utf-8811https://repositorio.ufscar.br/bitstream/ufscar/14311/5/license_rdfe39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34MD55TEXTTESE Mariele Carvalho - Final_Banca_propgweb.pdf.txtTESE Mariele Carvalho - Final_Banca_propgweb.pdf.txtExtracted texttext/plain221308https://repositorio.ufscar.br/bitstream/ufscar/14311/6/TESE%20Mariele%20Carvalho%20-%20Final_Banca_propgweb.pdf.txtd9ab1fe9c7098752fc851666dfb8ae7cMD56Carta-comprovante Mariele.pdf.txtCarta-comprovante Mariele.pdf.txtExtracted texttext/plain1673https://repositorio.ufscar.br/bitstream/ufscar/14311/8/Carta-comprovante%20Mariele.pdf.txta67c1100363ce48482aade660d5ba29eMD58THUMBNAILTESE Mariele Carvalho - Final_Banca_propgweb.pdf.jpgTESE Mariele Carvalho - Final_Banca_propgweb.pdf.jpgIM Thumbnailimage/jpeg7528https://repositorio.ufscar.br/bitstream/ufscar/14311/7/TESE%20Mariele%20Carvalho%20-%20Final_Banca_propgweb.pdf.jpgdab80ecf49596e57e6863f3338cac1d8MD57Carta-comprovante Mariele.pdf.jpgCarta-comprovante Mariele.pdf.jpgIM Thumbnailimage/jpeg14615https://repositorio.ufscar.br/bitstream/ufscar/14311/9/Carta-comprovante%20Mariele.pdf.jpg7d9c20e4ef72d5c6d07afdd5a9e5ff36MD59ufscar/143112023-09-18 18:32:11.21oai:repositorio.ufscar.br:ufscar/14311Repositório InstitucionalPUBhttps://repositorio.ufscar.br/oai/requestopendoar:43222023-09-18T18:32:11Repositório Institucional da UFSCAR - Universidade Federal de São Carlos (UFSCAR)false |
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