Comparação entre cinco diferentes métodos de extração de RNA exossomal de sobrenadante de saliva liofilizado

• Autor(a) principal: Cruz, Valquíria Quinelato
• Data de Publicação: 2018
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da Universidade Federal Fluminense (RIUFF)
• Texto Completo: https://app.uff.br/riuff/handle/1/11780
• topic: Biópsia líquida; Saliva; Vesículas extracelulares; MiRNAs circulantes; Liofilização; Diagnóstico bucal; Biópsia; Saliva; MicroRNAs; Liquid biopsies; Saliva; Extracellular vesicles; Circulating miRNAs; Lyophilization

Os miRNAs salivares apresentam-se como um potencial biomarcador por ser mensurável, previamente ou durante, à manifestação clínica de inúmeras doenças, assim como são alvos terapêuticos para o desenvolvimento de medicamentos. No entanto, não há protocolos específicos, pré-definidos, para obtenção de miRNA salivar. Por isso, o objetivo deste estudo foi realizar uma análise comparativa do desempenho do isolamento manual e purificação de miRNA de saliva, pelo processo de liofilização, comparando 5 diferentes métodos. A coleta de saliva foi realizada por meio de bochecho com solução fisiológica a 0,9% por 1 minuto. O método de isolamento do sobrenadante da saliva foi baseado em centrifugações escalonadas seguidas de liofilização, isolando as vesículas extracelulares. Posteriormente, isolouse o RNA total por 5 diferentes métodos: Trizol, mirCURYTM RNA Isolation Kit, mirCURYTM RNA Isolation Kit modificado, RNA total mirVanaTM miRNA Isolation kit, Small RNA mirVanaTM miRNA Isolation kit, seguido de purificação por solução de clorofórmio/fenol 1:1. A avaliação da concentração e pureza do RNA total foi realizada através do espectofotômetro . A reação em cadeia polimerase confirmou a presença de miRNAs nas amostras isoladas. De acordo com o método utilizado, a concetração do miRNA obtido foi de 162,47(±22,57) - 234,33(±26,97) ng/µl, apresentando razão de pureza (260/280) de 1,71(±0,03) - 1,85(±0,08) e razão (260/230) de 1,88(±0,15) - 2,11(±0,06). A análise por Real Time PCR quantitativo demonstrou a presença do mir-146b nas amostras isoladas pelos 5 métodos. Quatro métodos analisados foram capazes de isolar RNA total de sobrenadante de saliva liofilizado com razão de pureza (260/280) superior a 1,79 (±0.02). O método total RNA mirVana apresentou amostras mais ricas em microRNA em relação aos demais métodos analisados, apresentando assim menor valor médio C(q)=29.80(±0.95).