Desenvolvimento e avaliação de um ensaio imunoenzimático, usando antígeno multiepítopos, para o diagnóstico laboratorial da esquistossomose mansoni

• Autor(a) principal: Karine Ferreira Lopes
• Data de Publicação: 2020
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFMG
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/1843/65119
• topic: Schistosoma mansoni; Diagnóstico; Antígeno multiepítopos; Sorologia; Baixa carga parasitária; Parasitologia; Schistosoma mansoni; Diagnóstico; Sorologia; Carga Parasitária; Epitopos

A esquistossomose mansoni é uma doença de evolução crônica, causada pelo parasito Schistosoma mansoni, que ainda representa um sério problema de saúde pública no Brasil. O diagnóstico laboratorial da esquistossomose mansoni, realizado por meio da detecção de ovos do parasito nas fezes, apresenta baixa sensibilidade quando aplicado em indivíduos com baixa carga parasitária, o que dificulta o controle e erradicação da doença. Os testes sorológicos podem ser mais sensíveis para o diagnóstico da infecção, principalmente quando se faz uso de antígenos recombinantes. Esses antígenos podem conter epítopos específicos de uma ou mais proteínas, aumentando a sensibilidade e especificidade do teste. Diante disso, o objetivo desse trabalho foi desenvolver e avaliar um ensaio imunoenzimático de ELISA, usando um antígeno multiepítopos, produzido através da tecnologia do DNA recombinante. Para isso, as sequências de aminoácidos da catepsina B e da asparaginil endopeptidase de S. mansoni foram submetidas à predição de epítopos de células B usando os preditores BepiPred 2.0 e o método de antigenicidade descrito por Kolaskar & Tongaonkar, para selecionar as regiões peptídicas com maior potencial antigênico. Juntamente com sequências peptídicas obtidas de trabalhos anteriores, estas foram retrotraduzidas em sequências nucleotídicas e utilizadas na construção de um minigene. O minigene foi inserido no plasmídeo pET28a e a construção foi transformada em E. coli BL21(DE3) pLysS, para produção do antígeno multiepítopos em larga escala. Após análise de solubilidade, o antígeno recombinante foi purificado por cromatografia de afinidade com resina sensibilizada com níquel, em condições desnaturantes. Em seguida, esse antígeno foi renaturado por meio de diálise contra soluções de ureia em concentrações decrescentes. Esse antígeno foi utilizado para sensibilizar microplacas de poliestireno em uma concentração ótima, previamente determinada por titulação em bloco contra diferentes diluições de soros controles positivos, negativos e conjugado anti-IgG-peroxidase, para padronizar um ensaio de ELISA, denominado ELISA IgG anti-SmME. O desempenho do ELISA IgG anti-SmME foi avaliado em usando 118 amostras de soro de participantes positivos e negativos para esquistossomose, além de amostras de participantes com outras helmintoses. Posteriormente, o ensaio foi aplicado em amostras de indivíduos antes e após três, seis e doze meses de tratamento com praziquantel, para avaliar o nível de anticorpos IgG em indivíduos ovo-negativos e reinfectados. Usando um ponto de corte definido pela análise da curva ROC (Receiver Operating Curve), o ELISA IgG anti-SmME apresentou sensibilidade de 68%, especificidade de 66% e acurácia diagnóstica de 67%. A maioria dos participantes com esquistossomose mansoni apresentou baixa carga parasitária. Nesses participantes o ELISA IgG anti-SmME apresentou 68% de sensibilidade na detecção dos indivíduos com ≤ 12 opg (ovos por grama de fezes) e 67% na detecção dos indivíduos com 13-99 opg. Nos pacientes ovo-positivos para S. mansoni e tratados com praziquantel, não foi possível observar queda nos níveis de anticorpos, mesmo até 12 meses após tratamento. Vale destacar que esse foi o primeiro estudo usando um antígeno recombinante multiepítopos no ensaio de ELISA, para diagnóstico da esquistossomose mansoni. O mesmo demonstrou aplicabilidade no diagnóstico de indivíduos com baixa carga parasitária. Nesse sentido, novos trabalhos deverão ser realizados para melhorar o desempenho do ELISA IgG anti-SmME e torná-lo uma alternativa para o diagnóstico laboratorial da esquistossomose mansoni.