Produção e purificação de DNA plasmidial a partir de Escherichia coli recombinante

• Autor(a) principal: MOREIRA, Keila Aparecida
• Data de Publicação: 2003
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFPE
• dARK ID: ark:/64986/0013000001nwq
• Texto Completo: https://repositorio.ufpe.br/handle/123456789/1851
• topic: Microbiologia; Biotecnologia

A produção e a purificação de DNA plasmidial com elevado grau de pureza tem tido um elevado interesse nos últimos anos, devido fundamentalmente aos desenvolvimentos de técnicas de medicina molecular, como a terapia gênica e a vacinação com DNA. O plasmídeo pD2 foi produzido em diferentes condições de cultivo, sendo analisado várias parâmetros durante o crescimento, tais como, influência da velocidade de agitação (120, 160 e 200 rpm), concentrações de canamicina (10, 20, 30, 40 e 50mg ml-1) e meio de cultura (Terrific Broth - TB ou Luria Bertani com glicose - LBG). Foram também investigados o efeito da partição de DNA plasmidial, RNA e proteínas totais nos sistemas de duas fases aquosas (SDFA) do tipo polietileno glicol (PEG)/sal de fosfato de sódio dibásico (K2HPO4) do plasmídeo (pD2) durante o processo de purificação. Analisou-se a influência da massa molar do PEG, massa que carrega o sistema da solução de lise (20, 40 ou 60% m/m) na partição do plasmídeo. A técnica de precipitação com sulfato de amônio (2,0, 2,5 e 3,0M), seguido da técnica cromatográfica de interação hidrofóbica (CIH) utilizando como matriz estacionária o suporte Phenyl Sepharose 6 Fast Flow foram utilizadas para purificar o plasmídeo pVax-LacZ. A velocidade de agitação que apresentou os melhores resultados para a produção de biomassa e DNA plasmidial foi a 200 rpm, enquanto as concentrações 30- 50mg mL-1 de canamicina apresentaram resultados semelhantes para todas as condições estudadas. O meio de cultura TB apresentou ser o melhor em termos de produção de DNA plasmidial e biomassa, neste meio de cultura o plasmídeo foi mais estável, apresentando 82% de células contendo o plasmídeo. O DNA plasmidial foi particionado entre a fase superior e inferior na dependência da massa molar do polímero constituinte do sistema, tendo uma grande quantidade de proteína do lisado celular acumulada na interfase dos sistemas. O melhor rendimento plasmidial (37%) foi obtido com sistema PEG 400/K2HPO4 (20/20% m/m) carregado com 60% (m/m) de lisado celular. O procedimento de precipitação com sulfato de amônio (2,5M) seguido da cromatografia de interação hidrofóbica foram capazes de separar proteínas e DNA genômico do plasmídeo, obtendo 51% de rendimento e um fator de purificação de 3,3