Caracterização de uma linhagem de células-tronco embrionárias humanas para uso em estudos futuros em medicina regenerativa

• Autor(a) principal: Calderaro, Pedro Cervo
• Data de Publicação: 2013
• Tipo de documento: Trabalho de conclusão de curso
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFRGS
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10183/96790
• topic: Células-tronco embrionárias

As células-tronco embrionárias são derivadas da massa celular interna de embriões no estágio de blastocisto. Essas células são pluripotentes, podendo diferenciar-se em qualquer tipo celular do organismo. Após o processo de obtenção dessas células, é importante a realização de sua caracterização. A caracterização das células permite verificar a presença dos marcadores indicativos de pluripotência, bem como a sua capacidade de se diferenciar em derivados das três camadas germinativas. Dessa forma, o objetivo do presente trabalho foi caracterizar uma linhagem de células-tronco embrionárias humanas que serão futuramente utilizadas em experimentos visando a medicina regenerativa. A linhagem de células-tronco embrionárias humanas utilizada para esse trabalho foi a H9. Ela foi cultivada sobre uma monocamada de fibroblastos embrionários murinos pré-tratados com mitomicina C. O meio utilizado para manutenção das células foi o DMEM/F-12 suplementado com soro Knockout, antibióticos, aminoácidos não-essenciais, β-mercaptoetanol, Glutamax, Y-27632 e FGF2. As células foram mantidas em estufa a 37°C com 5% de CO2 e 95% de umidade. A caracterização teve início com a observação da morfologia das colônias, com a contagem cromossômica e com a avaliação da atividade da fosfatase alcalina. Após, realizou-se a avaliação por imunofluorescência utilizando-se anticorpos anti-OCT4, SOX2 e TRA-1-81, bem como RTPCR dos marcadores de pluripotência OCT4, NANOG, SOX2 e REX1. Para analisar o potencial de diferenciação foi feito o teste de formação de corpos embrioides, os quais foram avaliados por imunofluorescência para marcação de ectoderme (nestina e β-III-tubulina) e endoderme (SOX17). Também se realizou a avaliação da diferenciação sem a formação de corpos embrioides, sendo feita ao final a coloração com Oil red O. A análise dos resultados mostrou que as colônias apresentavam a morfologia típica de células-tronco embrionárias humanas, além do número cromossômico normal e a presença da atividade da fosfatase alcalina. Todos os marcadores analisados por imunofluorescência foram identificados, assim como os analisados por RT-PCR e foi comprovada a capacidade da linhagem diferenciar derivados das três camadas germinativas. Portanto, todos os testes demonstraram que a linhagem utilizada possui as características determinantes para sua classificação como célula-tronco embrionária humana.