Papel do Sindecam-4 na sinalização de células endoteliais resistentes ao anoikis

• Autor(a) principal: Machado, Ranyelison Silva [UNIFESP]
• Data de Publicação: 2023
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UNIFESP
• Texto Completo: https://repositorio.unifesp.br/handle/11600/68403
• topic: Anoikis; Resistência ao anoikis; Sindecam-4; Vias de sinalização; PI3K/AKT; Ras/ERK

A morte celular programada por falta de adesão da célula à matriz extracelular é denominada anoikis. Muitas células tumorais são resistentes ao anoikis, o que facilita a invasão dessas células em outros tecidos, assim favorecendo a metástase tumoral. Dados anteriores do nosso laboratório demonstraram que células endoteliais resistentes ao anoikis apresentam alterações morfológicas, alta taxa de proliferação, baixa adesão à fibronectina, laminina e colágeno IV, desregulação do ciclo celular, além de elevado potencial invasivo, baixa taxa de apoptose, aumento na expressão de sindecam-4 e aumento na expressão de PI3K, ERK e H-Ras. Foi demonstrado que o silenciamento gênico do sindecam-4 reverteu o comportamento tumoral das células endoteliais resistentes ao anoikis, diminuindo a capacidade proliferativa, invasiva e angiogênica e aumentando a adesão celular. Esses processos celulares são mediados por vias de sinalização, onde as células estão constantemente enviando e recebendo sinais ao seu redor. Embora alguns estudos tenham demonstrado o papel do sindecam-4 na regulação desses processos biológicos, poucos definiram o papel específico dessa macromolécula na sinalização celular. O objetivo desse trabalho é estudar a expressão das proteínas envolvidas nas vias de sinalização PI3K/AKT e Ras/ERK em células endoteliais da aorta de coelho resistentes ao anoikis, buscando um melhor entendimento do papel do sindecam-4 na regulação da sinalização celular. Para isso, estudamos comparativamente células endoteliais de aorta de coelho (EC), EC transfectadas com oncogene EJ-ras (EJ-ras-EC), células endoteliais de aorta de coelho resistente ao anoikis (Adh-EC) e células endoteliais resistentes ao anoikis (Adh1-EC) que foram transfectadas com micro RNA de interferência para o sindecam-4 (miR-Syn-4-1-Adh1-EC e miR-Syn-4-2-Adh1-EC). Para o estudo da expressão gênica foi realizada a técnica de qPCR em tempo real (RT-qPCR) e para a expressão proteica foi realizado o ensaio de Western Blotting. A determinação da localização dessas proteínas foi realizada utilizando a técnica de imunofluorescência. Os dados obtidos foram analisados estatisticamente utilizando o programa GraphPad Prism 6, com valor de significância p<0,05. Os resultados demonstraram que as linhagens silenciadas miR-Syn-4-1-Adh-EC e mir-Syn-4-2-Adh-EC apresentaram diminuição na expressão gênica de PI3K, PTEN, AKT, mTOR, H-Ras e ERK em relação às células anoikis resistentes (Adh1-EC). O silenciamento do sindecam-4 levou a uma diminuição na expressão proteica de PI3K total, PI3K (p85), AKT total, mTOR total, H-Ras e p 44/42 MAPK (ERK1/2). E as proteínas PTEN e PI3K (p110α) tiveram aumento na sua expressão nas linhagens silenciadas do estudo. Nas imagens obtidas pela técnica de imunofluorescência foi possível observar uma diminuição da expressão proteica de PI3K, mTOR, H-Ras e ERK nas linhagens miR-Syn-4-1-Adh-EC e miR-Syn-4-2-Adh-EC em relação a Adh1-EC, corroborando com os dados obtidos nos ensaios de Western Blotting. Assim, este estudo revelou que regulação negativa da expressão de SDC4 induziu a modulação das vias PI3K/AKT e Ras/ERK, promovendo a reversão do fenótipo alterado das células resistentes ao anoikis, levando-as a características semelhantes as células EC selvagens. Este estudo identificou o sindecam-4 como um regulador importante da sinalização celular em células resistentes ao anoikis e sugere que sua regulação negativa pode ser uma estratégia promissora para o tratamento do câncer.