Investigação dos genes drivers PTCH1, CTNNB1, DDX3X, TERT e TP53, e a relevância prognóstica de TP53 no meduloblastoma da infância e adolescência : da biologia molecular à clínica

• Autor(a) principal: Azevedo, Bruna Mascaro Cordeiro de [UNIFESP]
• Data de Publicação: 2017
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UNIFESP
• Texto Completo: https://sucupira.capes.gov.br/sucupira/public/consultas/coleta/trabalhoConclusao/viewTrabalhoConclusao.jsf?popup=true&id_trabalho=5053038; http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/50200
• topic: Meduloblastoma; NGS; Mutações; Polimorfismos; Tp53; HDACI; AV; beta Catenina; Medulloblastoma; NGS; Mutation; Polymorphism; Tp53; HDACI; VA; beta Catenin; Receptor patched-1; Patched-1 receptor

O Meduloblastoma (MB) é um tumor embrionário neuroepitelial do cerebelo, e um dos tumores cerebrais mais frequentes da infância e adolescência. A nova classificação é centrada nos aspectos biológicos, principalmente moleculares, que requerem um manejo terapêutico que respeite esses novos conhecimentos. No presente trabalho, estabelecemos um painel para a identificação de variantes genômicas em genes sabidamente importantes para a tumorigênese do MB. Além disso, foi investigado o comportamento celular e molecular de linhagens celulares de MB expostas ao tratamento com ácido valpróico (AV), um inibidor de desacetilases de histonas (HDACi), sozinho e combinado à cisplatina (CDDP), uma das drogas centrais no tratamento do MB. Para a identificação das variantes genômicas foi utilizada a metodologia de sequenciamento de nova geração (NGS) em 28 amostras tumorais e três linhagens celulares de MB (DAOY, D283MED e ONS-76). Todas as variantes identificadas foram validadas através do software IGV (http://www.broadinstitute.org/igv/), e comparadas com os bancos de dados: dbSNP, 1000 genomes, COSMIC e ExAC. O impacto das variantes foi investigado utilizando os preditores: SIFT, PolyPhen, e Mutation Taster. Foram observadas mutações e variantes de significado incerto (VUS) em uma média de 15 variantes/amostra, em todos os genes investigados por NGS. O gene PTCH1 apresentou o maior número de variantes/amostra. O gene CTNNB1 apresentou duas mutações no éxon 3, já descritas para o MB. O gene DDX3X apresentou apenas duas mutações classificadas como patogênicas. Os genes TERT e TP53 apresentaram sete e seis variantes exônicas, respectivamente, e para o gene TP53, observamos a presença de um polimorfismo (c.C215G:pP72R) em 74% das amostras. As quatro amostras portadoras de mutações em TP53, apresentaram concomitantemente mutações de PTCH1. A progressão de doença observada nos pacientes portadores dessas mutações concomitantes, corrobora com a recente estratificação de risco proposta. As três linhagens celulares de MB utilizadas neste estudo foram autenticadas por STR (Short Tandem Repeat), utilizando o kit de identificação GlobalFiler® PCR Amplification Kit (Applied Biosystems™/ThermoFisher Scientific®), apresentando índice de correspondência (IC) maior de 90%. As linhagens celulares foram submetidas a três regimes de tratamento: apenas com AV, apenas com CDDP, e AV e CDDP combinados. Após tratadas, as células foram avaliadas quanto a viabilidade, citotoxicidade, migração e invasão. Também foi realizada a investigação da expressão de genes relacionados ao processo tumorigênico do MB, por qRT-PCR, e analisado o perfil de metilação e acetilação, por Western Blott, nesses grupos de células. Na linhagem DAOY, o tratamento com CDDP foi o único significantemente eficaz em reduzir a viabilidade celular (p<0,0001). Já para as linhagens D283MED e ONS-76, o tratamento combinado foi mais eficaz em reduzir a viabilidade (p<0,0001). Devemos ressaltar que as linhagens D283MED e ONS-76, não apresentam mutação em TP53, o que deve interferir na resposta ao tratamento. Os níveis de expressão dos genes AKT, GLI1 e TERT, nas linhagens D283MED e ONS-76 tratadas com AV, isolado ou combinado, estavam significantemente aumentados (p<0.0001) quando comparados com os outros grupos de tratamento. No presente estudo observamos, que em linhagens celulares representativas de MB, a presença de mutação de TP53 é fator importante na resposta ao tratamento; o AV não colabora com a indução de morte celular nas células onde o gene TP53 está mutado; as células que sobrevivem ao tratamento com AV tem um potencial proliferativo aumentado e, genes centrais nas vias envolvidas com o processo de tumorigênese do MB, apresentam expressão significantemente maior do que o controle após tratamento com AV, evidenciando que o tratamento com AV deve ser considerado com atenção em pacientes com MB; a investigação de mutação do gene TP53 deve ser realizada para os pacientes com MB, para garantir a correta estratificação de risco; a frequência e a distribuição das mutações descritas em genes drivers no MB, merecem mais investigações em amostras de MB.