Determinação de diagramas de fases e do segundo coeficiente virial osmótico B22 na cristalização de proteínas com sal volátil carbamato de amônio

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Hirata, Gisele Atsuko Medeiros, 1984-
Data de Publicação: 2013
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1621840
Resumo: Orientadores: Everson Alves Miranda, Pedro de Alcântara Pessôa Filho
id UNICAMP-30_2b88f17cd8a964ce738e627c15fd080a
oai_identifier_str oai::919616
network_acronym_str UNICAMP-30
network_name_str Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
repository_id_str
spelling Determinação de diagramas de fases e do segundo coeficiente virial osmótico B22 na cristalização de proteínas com sal volátil carbamato de amônioDetermination of phase diagrams and osmotic second virial coefficient B22 in protein crystallization with the volatile salt ammonium carbamateCristalizaçãoDiagramas de faseSalProteínasInteração proteína-proteínaCrystallizationPhase diagramSaltProteinProtein-protein interactionsOrientadores: Everson Alves Miranda, Pedro de Alcântara Pessôa FilhoTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia QuímicaResumo: O segundo coeficiente virial osmótico, B22, tem sido considerado um preditor para o processo de cristalização. Uma faixa relativamente estreita de valores negativos de B22, -1x10-4 a -8x10-4 mL.mol/g2, é ideal à formação de cristais de acordo com George e Wilson (1994). Essa faixa de valores de B22 é denominada de "janela de cristalização", sendo utilizada para classificar condições adequadas de solvente à formação de cristais. Para valores maiores que -1x10-4 mL.mol/g2, a interação proteína-proteína não é suficientemente forte para a cristalização e nenhuma fase sólida é formada, enquanto para valores menores que -8x10-4 mL.mol/g2, as interações proteína-proteína são muito intensas e precipitados amorfos são formados. Dessa forma, os valores de B22 se tornaram um critério de seleção para a cristalização de proteínas, uma vez que esse coeficiente pode ser determinado por diversos métodos. Este trabalho teve como objetivo determinar experimentalmente diagramas de fases de proteínas (lisozima, insulina suína e bovina) e identificar nesses diagramas, através de análise dos valores do B22, as condições nas quais ocorre a formação de precipitado amorfo, cristalino ou outras fases (por exemplo, fase líquida). O "salting-out" foi o método escolhido para precipitar as proteínas, pois é considerado um dos mais simples e importantes métodos para induzir a cristalização. O sal volátil carbamato de amônio foi o agente de "salting-out" escolhido. As técnicas de espalhamento de luz estático (SLS) e cromatografia de auto-interação (SIC) foram usadas para determinar os valores de B22 para as proteínas em diferentes soluções aquosas de sal a 15 e 25 °C. O fenômeno de "salting-out" foi observado nos diagramas para as três proteínas estudadas. Valores negativos de B22 e altos valores da constante de "salting-out" - entre 1,07 a 3,77 kg/mol - confirmaram que o sal volátil carbamato de amônio empregado neste estudo é um bom agente precipitante. Os valores do B22 para a insulina suína (-250x10-4 a -18x10-4 mol.ml/g2 a 25 °C e -187x10-4 a -45,2x10-4 mol.ml/g2 a 15 °C) e insulina bovina (-999x10-4 a 6,7x10-4 mol.ml/g2 a 25 °C e -533x10-4 a -16,7x10-4 mol.ml/g2 a 15 °C) indicaram a precipitação, o que também foi confirmado pelos ensaios de cristalização. Já para a lisozima, obteve-se formação de cristais independente do valor de B22 encontrado (-20,4x10-4 a -3,6x10-4 mol.ml/g2 a 25 °C e -400x10-4 a -14,4x10-4 mol.ml/g2 a 15 °C). Além disso, os modelos teóricos disponíveis na literatura utilizados para a obtenção de uma estimativa do parâmetro B22 são adequados e válidos para as condições em que a medida experimental não é possível, podendo ser aplicados para o sistema proteína/sal volátil. Dessa forma, este trabalho mostrou que não existe uma "janela de cristalização universal" válida para todos os sistemas e o uso do sal volátil carbamato de amônio como agente de cristalização é uma alternativa ao uso de sais convencionais.Abstract: The osmotic second virial coefficient, B22, has been used as a predictor of crystallization. A relatively narrow range of negative B22 values, -1x10-4 to -8x10-4 mL.mol/g2, is the ideal range for crystal formation according to George and Wilson (1994). This range, referred to as the "crystallization slot", has been used to classify suitable conditions under which proteins will assemble into crystals. For B22 values greater than -1x10-4 mL.mol/g2, the protein-protein interaction is very weak and no solid phase is formed, while for values less than -8x10-4 mL.mol/g2, the protein-protein interactions are very intense and amorphous precipitates are formed. Thus, the B22 value has become a selection criterion for protein crystallization, since this coefficient can be determined by various methods. This study aimed to determine the experimental phase diagrams for proteins (lysozyme and bovine and porcine insulin) and to identify those diagram conditions under which amorphous precipitate, crystals or other phases (for example, liquid phase) are formed, based on the values of B22. The salting-out method to precipitate proteins was chosen because it is considered one of the simplest and most important methods to induce crystallization. The volatile salt ammonium carbamate was chosen as the salting-out agent. Traditional static light scattering (SLS) and the novel self-interaction chromatography (SIC) technique were used to determine B22 values for the proteins in different aqueous salt solutions at 15 and 25 °C. The salting-out phenomenon was observed in the phase diagrams for the three proteins studied. Negative B22 values and high values of the salting-out constant - between 1.07 to 3.77 kg/mole (Cohn, 1925) - confirmed that ammonium carbamate was a good precipitant agent. The B22 values for porcine (-250x10-4 to -18x10-4 mol.ml/g2 at 25 °C and -187x10-4 to -45.2 x10-4 mol.ml/g2 at 15 °C) and bovine (-999x10-4 to 6.7x10-4 mol.ml/g2 at 25 °C and -533x10-4 to -16.7x10-4 mol.ml/g2 at 15 °C) insulin indicated precipitation that was confirmed experimentally. However, lysozyme was obtained as crystals, regardless of the B22 values found (-20.4x10-4 to -3.6 x10-4 mol.ml/g2 at 25 °C and -14.4x10-4 to -400x10-4 mol.ml/g at 15 °C). In addition, thermodynamic models available in the literature and suitable for the conditions under which experimental measurements were done provided a good fit to the data. Thus, this work showed that there is no universal "crystallization slot" applicable to all systems and that for crystallization agent, volatile salt ammonium carbamate can serve as an alternative to conventional salts.DoutoradoDesenvolvimento de Processos BiotecnológicosDoutora em Engenharia Química[s.n.]Miranda, Everson Alves, 1959-Pessoa Filho, Pedro de AlcantaraWatanabe, Erika OhtaBernardo, AndreTashima, Alexandre KeijiMeirelles, Antonio José de AlmeidaUniversidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Faculdade de Engenharia QuímicaPrograma de Pós-Graduação em Engenharia QuímicaUNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASHirata, Gisele Atsuko Medeiros, 1984-20132013-09-12T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdf127 p. : il.https://hdl.handle.net/20.500.12733/1621840HIRATA, Gisele Atsuko Medeiros. Determinação de diagramas de fases e do segundo coeficiente virial osmótico B22 na cristalização de proteínas com sal volátil carbamato de amônio. 2013. 127 p. Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1621840. Acesso em: 3 set. 2024.https://repositorio.unicamp.br/acervo/detalhe/919616porreponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instname:Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instacron:UNICAMPinfo:eu-repo/semantics/openAccess2017-02-18T07:12:27Zoai::919616Biblioteca Digital de Teses e DissertaçõesPUBhttp://repositorio.unicamp.br/oai/tese/oai.aspsbubd@unicamp.bropendoar:2017-02-18T07:12:27Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)false
dc.title.none.fl_str_mv Determinação de diagramas de fases e do segundo coeficiente virial osmótico B22 na cristalização de proteínas com sal volátil carbamato de amônio
Determination of phase diagrams and osmotic second virial coefficient B22 in protein crystallization with the volatile salt ammonium carbamate
title Determinação de diagramas de fases e do segundo coeficiente virial osmótico B22 na cristalização de proteínas com sal volátil carbamato de amônio
spellingShingle Determinação de diagramas de fases e do segundo coeficiente virial osmótico B22 na cristalização de proteínas com sal volátil carbamato de amônio
Hirata, Gisele Atsuko Medeiros, 1984-
Cristalização
Diagramas de fase
Sal
Proteínas
Interação proteína-proteína
Crystallization
Phase diagram
Salt
Protein
Protein-protein interactions
title_short Determinação de diagramas de fases e do segundo coeficiente virial osmótico B22 na cristalização de proteínas com sal volátil carbamato de amônio
title_full Determinação de diagramas de fases e do segundo coeficiente virial osmótico B22 na cristalização de proteínas com sal volátil carbamato de amônio
title_fullStr Determinação de diagramas de fases e do segundo coeficiente virial osmótico B22 na cristalização de proteínas com sal volátil carbamato de amônio
title_full_unstemmed Determinação de diagramas de fases e do segundo coeficiente virial osmótico B22 na cristalização de proteínas com sal volátil carbamato de amônio
title_sort Determinação de diagramas de fases e do segundo coeficiente virial osmótico B22 na cristalização de proteínas com sal volátil carbamato de amônio
author Hirata, Gisele Atsuko Medeiros, 1984-
author_facet Hirata, Gisele Atsuko Medeiros, 1984-
author_role author
dc.contributor.none.fl_str_mv Miranda, Everson Alves, 1959-
Pessoa Filho, Pedro de Alcantara
Watanabe, Erika Ohta
Bernardo, Andre
Tashima, Alexandre Keiji
Meirelles, Antonio José de Almeida
Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Faculdade de Engenharia Química
Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
dc.contributor.author.fl_str_mv Hirata, Gisele Atsuko Medeiros, 1984-
dc.subject.por.fl_str_mv Cristalização
Diagramas de fase
Sal
Proteínas
Interação proteína-proteína
Crystallization
Phase diagram
Salt
Protein
Protein-protein interactions
topic Cristalização
Diagramas de fase
Sal
Proteínas
Interação proteína-proteína
Crystallization
Phase diagram
Salt
Protein
Protein-protein interactions
description Orientadores: Everson Alves Miranda, Pedro de Alcântara Pessôa Filho
publishDate 2013
dc.date.none.fl_str_mv 2013
2013-09-12T00:00:00Z
dc.type.status.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/publishedVersion
dc.type.driver.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
format doctoralThesis
status_str publishedVersion
dc.identifier.uri.fl_str_mv https://hdl.handle.net/20.500.12733/1621840
HIRATA, Gisele Atsuko Medeiros. Determinação de diagramas de fases e do segundo coeficiente virial osmótico B22 na cristalização de proteínas com sal volátil carbamato de amônio. 2013. 127 p. Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1621840. Acesso em: 3 set. 2024.
url https://hdl.handle.net/20.500.12733/1621840
identifier_str_mv HIRATA, Gisele Atsuko Medeiros. Determinação de diagramas de fases e do segundo coeficiente virial osmótico B22 na cristalização de proteínas com sal volátil carbamato de amônio. 2013. 127 p. Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1621840. Acesso em: 3 set. 2024.
dc.language.iso.fl_str_mv por
language por
dc.relation.none.fl_str_mv https://repositorio.unicamp.br/acervo/detalhe/919616
dc.rights.driver.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/openAccess
eu_rights_str_mv openAccess
dc.format.none.fl_str_mv application/pdf
127 p. : il.
dc.publisher.none.fl_str_mv [s.n.]
publisher.none.fl_str_mv [s.n.]
dc.source.none.fl_str_mv reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
instname:Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
instacron:UNICAMP
instname_str Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
instacron_str UNICAMP
institution UNICAMP
reponame_str Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
collection Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
repository.name.fl_str_mv Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
repository.mail.fl_str_mv sbubd@unicamp.br
_version_ 1809189109965520896

Registros relacionados