Ação do mastoparano Polybia-MPII nas fibras musculares e na junção neuromuscular : um estudo morfologico, imunohistoquimico e biofisico

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Rocha, Thalita, 1979-
Data de Publicação: 2008
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1607573
Resumo: Orientador: Maria Alice da Cruz Hofling
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spelling Ação do mastoparano Polybia-MPII nas fibras musculares e na junção neuromuscular : um estudo morfologico, imunohistoquimico e biofisicoMastoparan Polybia-MPII action on muscle fibres and neuromuscular junction a morphological, immunohistochemical and biophysical studyMionecroseAgentes neurotoxicosMúsculos - RegeneraçãoVespa - VenenoMionecrosisNeurotoxinsMuscle - RegenerationWasps - VenomOrientador: Maria Alice da Cruz HoflingTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: Venenos e toxinas de animais peçonhentos são importantes ferramentas farmacológicas para o estudo de fenômenos biológicos. Os venenos produzidos por insetos sociais da ordem Hymenoptera têm chamado a atenção de bioquímicos, imunologistas, farmacologistas e neurologistas, tanto do ponto de vista clínico como biotecnológico. Neste trabalho o mastoparano (MP) Polybia-MPII (INWLKLGKMVIDAL-NH2), do veneno da vespa Polybia paulista, serviu de ferramenta para avaliar se o peptídeo tem ação miotóxica e neurotóxica, bem como determinar a natureza dessa ação em biomembranas. A ação miotóxica foi avaliada pela análise morfológica ao microscópio de luz e eletrônico e morfometria durante as fases degenerativa (3 e 24 horas) e regenerativa (3, 7 e 21 dias) após a injeção intramuscular de 0,25 mg/ml do peptídeo. Com o objetivo de identificar os eventos celulares e moleculares que acompanham essas alterações nos diferentes períodos analisados, foi avaliada a expressão das citocinas pró-inflamatórias, o fator de necrose tumoral (TNF-a) e o interferon gama (IFN-g). Em geral, na avaliação da ação local de venenos e toxinas, tem sido dado ênfase à capacidade de induzir mionecrose e tem-se negligenciado a capacidade de induzir apoptose por parte dessas substâncias. No presente trabalho, através da técnica de TUNEL e da imunomarcação de caspases 3 e 9, foi analisado a capacidade do Polybia-MPII em promover morte celular programada por apoptose no músculo tibial anterior. A ação neurotóxica do Polybia-MPII foi avaliada por microscopia confocal e microscopia eletrônica de transmissão e consistiu em investigar a organização da inervação dos terminais em secções longitudinais através da marcação com alfa-bungarotoxina conjugada com tetrametilrodamina (TRITC-aBTX) ou com isotiocianato de fluoresceína (FITC-aBTX), e contra-imunomarcados com sinaptofisina (marcador específico para vesículas sinápticas) e neurofilamentos, e pela contagem de vesículas sinápticas nos terminais colinérgicos. Os resultados mostraram pela primeira vez que o mastoparano de P. paulista é um potente indutor de mionecrose e apoptose. A atividade miotóxica do peptídeo mostrou iniciar-se pela lise do sarcolema seguida por diferentes estados patológicos comprometendo a organização miofibrilar, seguida pela lise das miofibras e das miofibrilas, com preservação da lâmina basal. A indução de apoptose pelo peptídeo foi demonstrada morfologicamente pela técnica de TUNEL, presença de caspase 3 e 9 e pela severa alteração mitocondrial e alteração da cromatina dos núcleos observadas por microscopia eletrônica, as quais coincidiram com expressão aumentada de IFN-g e TNF-a, esta uma citocina que medeia a ativação de uma das via das caspases que leva à morte celular programada por apoptose. Com relação à atividade neurotóxica, os resultados mostraram que o Polybia-MPII possui ação pré-sináptica, devido à significativa diminuição no conteúdo de vesículas sinápticas nos terminais pré-sinápticos, corroborando com dados do nosso grupo que evidenciaram através de estudos eletrofisiológicos a mesma ação neurotóxica pré-sináptica causada pelo veneno bruto de P. paulista. Esses efeitos foram variáveis ao longo dos diferentes períodos analisados, mostrando que as alterações eram transitórias e que os fenômenos regenerativos permitiam o restabelecimento da morfologia original. Os estudos biofísicos feitos em membranas artificiais mostraram que o Polybia-MPII interage com a bicamada lipídica da membrana, provavelmente utilizando o triptofano como ancoragem através de um mecanismo conhecido como ¿carpet¿, desestabilizando o equilíbrio iônico e promovendo a ruptura da membrana. Os estudos biofísicos mostraram-se consistentes com as observações morfológicas ao microscópio de luz e eletrônico. Os dados permitem concluir que o mastoparano Polybia-MPII é um potente indutor de mionecrose em músculo esquelético e sua atividade neurotóxica periférica pode ser qualificada como moderada e pré-sináptica; além de induzir apoptose em fibra muscular, cujo significado precisa ser investigado. A reversibilidade dos efeitos causados pelo mastoparano está de acordo com os dados clínicos observados em acidentes com ferroadas de P. paulista em indivíduos não alérgicos, os quais se caracterizam na maioria por serem de pouca gravidade, curta duração e auto-limitantesAbstract: Venoms and toxins of poisonous animals are important pharmacological tools to study biological phenomena. The venom of social insects as those produced by Hymenoptera get attention from biochemistries, immunologists, biologists, pharmacologists and neurologists, as in a clinic view as biotechnologically. In this study the mastoparan (MP) Polybia-MPII, (INWLKLGKMVIDAL-NH2) from Polybia paulista wasp venom, was used as a tool to analyze if the peptide has myotoxic and neurotoxic effects, as well to determine its action on biomembranes. The myotoxicity of the mastoparan was evaluated during the degenerative phase (3 and 24 hours) and regenerative phase (3, 7 and 21 days) after the intramuscular injection of 0.25 mg/ml of the peptide using light microscopy, transmission electron microscopy and morphometry. With the purpose of determining the cellular and molecular events accompanying the alterations caused by P. paulista wasp mastoparan in these time-points the expression of proinflammatory cytokines, such as the tumor necrosis factor alpha (TNF-a) and interferon gamma (IFN-g) were evaluated. In general, studies on the local effects of venom and toxins have focused on their myotoxic potential, whereas the potential to induce apoptosis has been neglected. In this work, the ability of Polybia-MPII in inducing cell death by apoptosis on the tibial anterior muscle was assessed by TUNEL technique and immunohistochemistry for caspase 3 and caspase 9. The neurotoxic action of Polybia-MPII was evaluated by examining the organization of terminals innervation in longitudinal sections labelled with tetramethylrhodamineconjugated- or isothiocyanate fluorescein-conjugated-alpha-bungarotoxin (TRITC or FITC a-BTX receptor, respectively) and counter labelled with a combination of antisynaptophysin (a specific marker to synaptic vesicles) and anti-neurofilament protein using confocal microscopy and transmission electron microscopy, and by counting the synaptic vesicle within the cholinergic terminals. The results showed for the first time that the Polybia-MPII is a potent inducer of myonecrosis and apoptosis. The myotoxic action of the peptide initiated with the lyses of the sarcolemma followed by the development of different pathologic stages affecting myofibrillar organization, and eventually myofibrils and myofibre lyses, but maintaining unaffected the basal lamina. The ability of the peptide to induce apoptosis was demonstrated by TUNEL technique, immunolabelling of caspase 3 and 9, severe mitochondrial damage and alteration of the structure of nuclei chromatin seen by electron microscopy. Such effects were positively correlated with increased IFN-g and TNF-a expression, being the last one a cytokine which mediates the caspase pathway leading to programmed cell death by apoptosis. Concerning Polybia-MPII neurotoxicity, the results showed a pre-synaptic action of the peptide which was inferred by a decrease in synaptic vesicles content of pre-synaptic terminals, in agreement with electrophysiological studies done by our group with the P. paulista crude venom. These alterations varied along the time intervals analyzed, evidencing that the alterations were transitory and the regenerative phenomena allow to morphological reestablishment. The biophysical studies performed on artificial membranes, showed that the peptide interacted with the lipid bilayer probably anchored by tryptophan and by a mechanism known as carpet. As a result, the ionic balance is impaired inducing membrane leakage. The biophysical data were consistent with the morphological observations by light and electron microscopy. Data allow concluding that Polybia-MPII mastoparan is a mighty inducer of myonecrosis whereas the peripheral neurotoxicity could be considered as moderate and pres-synaptic. Besides, the peptide has an apoptotic-inducing potential on skeletal muscle fibre, the meaning of which deserves further investigation. The reversibility of the mastoparan effects is in accordance with clinical data in non-allergic patients stung by P. paulista, whose outcome is considered of mild, short-lived and self-limiting in severityDoutoradoBiologia CelularDoutor em Biologia Celular e Estrutural[s.n.]Cruz-Hofling, Maria Alice da, 1944-Marques, Maria JuliaOshima-Franco, YokoZamuner, Stella ReginaMinatel, ElaineUniversidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de BiologiaPrograma de Pós-Graduação em Biologia Celular e EstruturalUNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASRocha, Thalita, 1979-20082008-07-31T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdf145p. : il.https://hdl.handle.net/20.500.12733/1607573ROCHA, Thalita. Ação do mastoparano Polybia-MPII nas fibras musculares e na junção neuromuscular: um estudo morfologico, imunohistoquimico e biofisico. 2008. 145p. Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1607573. Acesso em: 2 set. 2024.https://repositorio.unicamp.br/acervo/detalhe/429979porreponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instname:Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instacron:UNICAMPinfo:eu-repo/semantics/openAccess2017-12-19T16:42:13Zoai::429979Biblioteca Digital de Teses e DissertaçõesPUBhttp://repositorio.unicamp.br/oai/tese/oai.aspsbubd@unicamp.bropendoar:2017-12-19T16:42:13Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)false
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