Desenvolvimento e validação de um protocolo de extração de RNA de células em cultura livre de fenol

• Autor(a) principal: Costa, Hudson Marques Paula
• Data de Publicação: 2017
• Tipo de documento: Trabalho de conclusão de curso
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UNIPAMPA
• Texto Completo: http://dspace.unipampa.edu.br:8080/jspui/handle/riu/3867
• topic: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS; Tiocianato de guanidina; Sulfato de amônio; Salting out; RNA; Guanidinium thiocyanate; Ammonium sulfate

O ácido ribonucleico (RNA) é um polímero de ribonucleotídeos encontrado no interior de células tanto eucarióticas como procarióticas e está quase sempre relacionado à expressão gênica. Para se obter resultados confiáveis em estudos de expressão gênica, é necessário extrair um RNA puro e íntegro. Técnicas para extração de RNA de alta qualidade vem sendo desenvolvidas e refinadas e as mais utilizadas atualmente são as de colunas cromatográfica de sílica presentes em kits comerciais e a técnica de tiocianato de guanidina – fenol – clorofórmio, utilizada em reagentes como o Trizol comercializado pela Thermofisher ou o TRI Reagent comercializado pela Sigma-Aldrich, entre outros. As duas técnicas extraem um RNA de alta pureza e qualidade. No entanto, solventes orgânicos como o fenol são tóxicos e interferem negativamente na quantificação do RNA por absorver luz UV no mesmo comprimento de onda do RNA. Colunas cromatográficas limitam a extração de RNA à quantidade que cada uma suporta além de tornar um método de alto custo quando se tem um grande número de amostras. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um protocolo de baixo custo de extração de RNA de alta qualidade a partir de células em cultura dispensando o uso do sistema orgânico FenolClorofórmio. O RNA foi extraído de células K562 (entre 1 e 3 x 106 células por reação) cultivadas em meio RPMI 1640, seguindo procedimento padrão. As células foram separadas do meio de cultura por centrifugação e ressuspendidas em uma solução tampão (pH 7,8) contendo 140 mM de NaCl, 1,5 mM de MgCl2, 10 mM de TRIS. As células foram fracionadas em tubos de reação de 1,5 mL e lisadas adicionando 0,2 volumes de DTT 2 M e 0,1 volume de solução de NP-40 (10% v/v) em vortex. Os núcleos foram removidos por centrifugação e o sobrenadante contendo o RNA foi submetido a desnaturação proteica com tiocianato de guanidina na concentração final de 1 M. Posteriormente, um processo de purificação do RNA foi realizado por salting out com sulfato de amônio na concentração final de 1 M. Finalmente, o RNA foi precipitado em 0,1 volume de acetato de sódio e 0,6 volumes de isopropanol a -20 ºC, o precipitado foi lavado com isopropanol 50 % e eluído em água ultrapura. Como controle foi utilizado RNA extraído por colunas cromatográficas de kit comercial seguindo orientações do fabricante. As extrações foram realizadas no mesmo dia com a mesma quantidade de células e nas mesmas condições. Foram realizadas análises de eletroforese em gel de agarose não desnaturante, quantificação de proteínas por Bradford, RT-PCR e qRT-PCR para avaliar o RNA extraído pelo método TGSA (tiocianato de guanidina – sulfato de amônio; descrito neste trabalho) em comparação com o RNA extraído por coluna cromatográfica. As análises demonstraram que o método TGSA permite extrair RNA de alta qualidade com características similares às apresentadas pelo RNA extraído com colunas cromatográficas. Além disso, foram feitos orçamentos de reagentes necessários para extração de RNA com método TGSA e um comparativo de preços com os kits comerciais. O método de TGSA custou R$ 1,61 por reação com reagentes de vários fornecedores e R$ 2,66 por reação com todos os reagentes da empresa Sigma Aldrich. Isso representa um valor aproximadamente 8,4 vezes inferior ao necessário para realizar a extração de RNA de alta qualidade com o método de menor custo na presente data (PureLink RNA mini kit – Thermo Fishier).