Estudos estruturais de histatina-5 e seu análogo, TOAC0-histatina-5: interação com metais e sistemas biomiméticos

• Autor(a) principal: Dyszy, Fábio Henrique
• Data de Publicação: 2008
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-03122008-140645/
• topic: Biological membranes; Electron paqramagnetic resonance (Applications); Fluorescence (Applications); Fluorescência (Aplicações); Histatin-5; Histatina-5; Ions metálicos; Membranas biológicas; Membranas modelo; Metal ions; Model membranes; Peptídeos (Síntese); Peptides (Synthesis); Relações estrutura-atividade; Ressonância paramagnética eletrônica (Aplicações); Spectroscopic techniques; Técnicas espectroscópicas; TOAC; TOAC

O mecanismo de ação da Histatina-5 (Hst-5), um peptídeo antimicrobiano da saliva humana com ação fungicida, não está esclarecido. Dicroísmo circular (CD), fluorescência e ressonância paramagnética eletrônica (RPE) foram empregados para examinar as propriedades conformacionais de Hst-5 e seu análogo contendo o aminoácido paramagnético TOAC N-terminal (TOAC0-Hst-5) em solução aquosa, em função do pH, de TFE, e de íons metálicos, e em presença de membranas modelo de composição. Foi examinada a atividade dos dois peptídeos em membranas lipídicas planas, na permeabilização de membranas modelo e frente o fungo Candida albicans e eritrócitos humanos, com o objetivo de estabelecer correlações entre a atividade e a estrutura dos peptídeos. Estudos de fluorescência mostraram a capacidade de TOAC de suprimir a fluorescência e que o pK dos resíduos de Tyr foram deslocados. Espectros de CD mostraram pequenas flutuações conformacionais, mas foram mantidas estruturas ao acaso. Espectros de RPE de TOAC0-Hst-5 mostraram a coexistência de duas populações, protonada e desprotonada, em troca lenta. A partir de medidas de desdobramento hiperfino (aN), foram calculados pKs de TOAC; a relação de altura dos picos de campo central e alto também foi sensível à titulação do peptídeo. Em TFE os peptídeos adotaram conformação α-helicoidal (CD). Espectros de fluorescência de Hst-5 mostraram aumento da fluorescência, e os de TOAC0-Hst-5 mostraram supressão, indicando aproximação de TOAC dos resíduos de Tyr. Espectros de RPE de TOAC0-Hst-5 também refletiram as mudanças conformacionais. Estudos de fluorescência mostraram a interação de Hst-5 e TOAC0-Hst-5 com Cu2+, Mn2+ e Zn2+, permitindo o cálculo de constantes de ligação. Espectros de CD refletiram pequenas variações conformacionais, sem aquisição de estrutura secundária. Espectros de RPE de TOAC0-Hst-5 na presença dos íons paramagnéticos Cu2+ e Mn2+ indicaram interações spin-spin, permitindo o cálculo das distâncias metal-nitróxido. Curvas de tempo de correlação rotacional em função da concentração dos íons permitiram calcular constantes de ligação da mesma ordem de grandeza daquelas obtidas por fluorescência. Hst-5 e TOAC0-Hst-5 ligaram-se em maior extensão a micelas negativas do que a zwitteriônicas num processo pH-dependente. Estudos de supressão de fluorescência por acrilamida confirmaram esses resultados, indicando a modulação por interações eletrostáticas. Espectros de CD mostraram que os peptídeos adotam conformação em dobra β tipo I. Estudos de RPE da interação de TOAC0-Hst-5 com vesículas de composição lipídica mimetizando membranas de E. coli e C. albicans (carga líquida negativa) e eritrócitos (carga líquida zero) confirmaram essa modulaçao. Na presença das membranas negativamente carregadas os espectros apresentaram extremos externos e internos, indicando que o eixo z do nitróxido orienta-se paralelamente à normal à bicamada. Estudos funcionais utilizando bicamadas lipídicas planas mostraram que TOAC0-Hst-5, mas não Hst-5, forma poros. Também, TOAC0-Hst-5, mas não Hst-5, permeabiliza vesículas carregadas negativamente. Ainda, a atividade fungicida de TOAC0-Hst-5 foi maior do que a de Hst-5 na ausência de íons, porém foi a mesma na presença de Mn2+ e Zn2+. Finalmente, TOAC0-Hst-5 mostrou maior atividade hemolítica que Hst-5. Esses resultados sugerem uma possível diferença nos mecanismos de ação de Hst-5 e seu análogo marcado, apesar da semelhança no comportamento conformacional dos peptídeos.