Erradicação de biofilmes bacterianos mono e multiespécies pela terapia fotodinâmica utilizando a microbiologia preditiva multivariada e novos fotossensibilizadores

• Autor(a) principal: Amaral, Larissa Souza
• Data de Publicação: 2020
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/82/82131/tde-24082021-173940/
• topic: Enterococcus faecali; Escherichia coli; Estafilococos aureus resistente a meticilina; Antimicrobial Photodynamic Therapy, Predictive Microbiology; Biofilmes Bacterianos; Factorial Design, Bacterial Biofilm; Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis; Microbiologia Preditiva, Planejamento Fatorial; Terapia Fotodinâmica Antimicrobiana

Estima-se que em 2050 a mortalidade por infecções causadas por bactérias resistentes chegue a 10 milhões de casos por ano. Devido à resistência bacteriana é prioritário o desenvolvimento de novas drogas e/ou tecnologias para a erradicação desses patógenos. A Terapia Fotodinâmica Antimicrobiana (TFD-A) é uma alternativa promissora, uma vez que sua ação ocorre por múltiplos alvos o que dificultaria o desenvolvimento de resistência. TFD-A envolve a combinação de um fotossensibilizador (FS), oxigênio molecular e luz visível de comprimento de onda adequado para produzir espécies reativas de oxigênio (EROs) levando o microrganismo à morte. O objetivo desse estudo foi utilizar técnicas variadas para evidenciar a fotoinativação de biofilmes bacterianos mono e multiespécies via TFD-A empregando-se a microbiologia preditiva e novos FSs ainda não utilizados para essa aplicação. O uso da microbiologia preditiva utilizando o Planejamento Fatorial 23 propiciou o entendimento particularizado e aprofundado dos melhores parâmetros bem como seus níveis, suas interações e os efeitos individuais em cada condição. A clorina CHL-OH-A possibilitou uma fotoinativação maior dos biofilmes de E. coli (39 e 62%), E. faecalis (79 e 92%) e multiespécies (48 e 72%) enquanto que a CHL-Ph-A para o biofilme de S. aureus resistente à meticilina (53 e 89%) nos dois comprimentos de onda utilizados (660 e 403 nm), respectivamente. A Microscopia Eletrônica de Varredura possibilitou a observação da alteração morfológica tanto das bactérias quanto da estrutura do biofilme. A Microscopia de Fluorescência (MF) permitiu comprovar a evasão citoplasmática decorrente da peroxidação da bicamada fosfolipídica, também observada pela Espectroscopia Vibracional de Absorção na Região do Infravermelho com Transformada de Fourier. A MF também foi importante para validar, qualificar e quantificar a acumulação das clorinas em biofilmes através da análise de intensidade × pixels. A Microespectroscopia Raman permitiu a observação dos biocomponentes bacterianos que podem ser possíveis alvos do processo fotodinâmico. A Microscopia Ótica bem como a Espectroscopia de absorção no visível utilizando safranina 1% foram essenciais para visualizar e constatar a desestruturação da matriz exopolissacarídica bem como quantificar a biomassa do biofilme, respectivamente. Potencializar os efeitos fotodinâmicos com iodeto de potássio (KI)foi crucial para a obtenção de menores índices de sobrevivência bacteriana chegando a 100% de erradicação para E. faecalis e S. aureus resistente à meticilina. Ensaios de seletividade com Balb 3T3 Clone A31 e de hemólise dos eritrócitos foram fundamentais para a compreensão dos efeitos que as clorinas e os comprimentos de onda da luz usados na irradiação durante a TFDA tem sobre a membrana citoplasmática de células eucarióticas. A comparação da TFD-A com o uso do antibiótico de largo espectro foi importante para observar a eficiência da técnica. Esses resultados mostram as vantagens e a importância de uma abordagem multivariada em experimentos que envolvam a TFD-A. Além disso, este estudo chama a atenção para os benefícios do uso de metodologias que possam evidenciar o efeito antimicrobiano além da constatação típica da morte celular. Além do mais, foi comprovado que as novas clorinas apresentam elevado potencial fotodinâmico in vitro, sendo ótimas candidatas como fotossensibilizador em abordagens clínicas.