Nanopartículas formadas por proteínas recombinantes modulares como plataformas de gene delivery e combate às células tumorais

• Autor(a) principal: Oliveira, Fernanda Santos de
• Data de Publicação: 2023
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/3/3137/tde-17072023-151603/
• topic: Células tumorais; Gene therapy; Nanoparticles; Nanopartículas; Proteínas recombinantes; Recombinant proteins; siRNA; siRNA; Terapia gênica

Terapias avançadas, como a terapia gênica, têm sido amplamente estudadas para o tratamento do câncer. Muitos destes estudos baseiam-se no uso de vetores virais para a entrega de ácidos nucléicos para as células alvo. No entanto, ainda existem problemas recorrentes nesses estudos, tais como; 1) a dificuldade da entrega gênica para células tumorais devido à presença de barreiras físicas, enzimáticas e difusionais; 2) a estimulação de resposta inflamatória pelo sistema imune devido ao uso de vetores virais e; 3) os custos elevados para produção destes vetores. Uma alternativa para a superação destes obstáculos é o uso de proteínas recombinantes especificamente desenhadas para entrega gênica e combate às células tumorais. São, em geral, proteínas modulares, multifuncionais e capazes de mimetizar a habilidade dos vírus de explorar as sinalizações e respostas extra- e intracelulares para infectar as células. Dessa forma, o principal objetivo deste mestrado foi o desenvolvimento e caracterização de proteínas recombinantes multifuncionais capazes de realizarem eficientemente o transporte de material genético (RNA de interferência) para o interior de células tumorais. Para isso, a proteína repórter GFP foi fusionada a uma desintegrina (Echistatina) servindo como domínio de direcionamento para células tumorais. A proteína também contém uma poliarginina (R6) que interage e condensa o material genético a ser entregue. Quatro diferentes construções gênicas foram sintetizadas e expressas em Escherichia coli: construção 1 completa (H6-R6-GFP-ECH); construção 2 - sem Echistatina (H6-R6-GFP); construção 3 - sem a sequência R6 (H6-GFP-ECH); e construção 4 - (H6-R9-GFP-ECH), contendo a sequência R9 com potencial de induzir a formação de nanopartículas. As proteínas foram produzidas em E. coli e purificadas por cromatografia de afinidade, sem obstáculos quanto à toxicidade para a bactéria. A fluorescência das diferentes construções foi analisada e comparada. O comportamento hidrodinâmico das proteínas em solução foi também avaliado por DLS, com e sem a presença de pDNA, verificando-se assim interação com ácido nucléico e formação de nanopartículas. Estudos de atividade biológica em células in vitro indicam que a construção 1 foi capaz de direcionar e facilitar a entrada de siRNAs nas células que superexpressam receptores integrinas (células U87MG). Nos ensaios de citotoxicidade também foi demonstrado o potencial da própria proteína que, por si só, foi capaz de diminuir a viabilidade das células que super expressam integrinas, sendo ela própria um potencial agente antitumoral.