Análise proteômica da atividade proteolítica do HF3, uma metaloproteinase do veneno da Bothrops jararaca, no plasma humano e de serpente

• Autor(a) principal: Nasciben, Luciana Bertholim
• Data de Publicação: 2014
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-20012015-083705/
• topic: Bothrops jararaca; Bothrops jararaca; Degradômica; Degradomics; Espectrometria de massas; Hemorrhagic factor 3; HF3; Mass spectrometry; Plasma; Plasma; Proteômica; Proteomics

A hemorragia gerada por metaloproteinases de venenos de serpentes é um fenômeno complexo que resulta na ruptura de capilares e extravasamento de sangue. O HF3 (fator hemorrágico 3) é uma metaloproteinase da classe P-IIIa, extremamente hemorrágica, isolada do veneno da serpente Bothrops jararaca. Análises de sua atividade proteolítica sobre proteínas isoladas mostraram que componentes do plasma e da matriz extracelular são hidrolisados pelo HF3. Estudos que utilizaram abordagens proteômicas para analisar os efeitos do HF3 na derme e plasma de camundongos evidenciaram novos alvos desta metaloproteinase, incluindo proteínas intracelulares, extracelulares e plasmáticas. Entretanto, os mecanismos envolvidos na alta atividade hemorrágica apresentada pelo HF3, principalmente no que se diz respeito ao papel da clivagem de proteínas plasmáticas no contexto da hemorragia, ainda não são conhecidos. Assim, o objetivo principal deste estudo foi analisar o degradoma do HF3 no plasma humano. Paralelamente, também realizamos a análise da atividade do HF3 sobre as proteínas do plasma da B. jararaca. Para tanto, abordagens para a depleção das proteínas mais abundantes e enriquecimento de proteínas pouco abundantes do plasma humano foram utilizadas visando minimizar o intervalo de concentração dinâmica de proteínas, e assim permitir a avaliação da atividade proteolítica do HF3 sobre um amplo espectro de proteínas, e possibilitar a detecção dos produtos de degradação por espectrometria de massas. Dessa forma, quatro amostras de plasma humano foram utilizadas neste estudo: plasma total, plasma depletado de albumina, plasma depletado das 20 proteínas mais abundantes e plasma enriquecido de proteínas pouco abundantes. A incubação das amostras de plasma humano com o HF3 foi realizada na proporção enzima:substrato 1:100 (p/p), por 2 h a 37°C. Decorrido o tempo de incubação, as frações peptídica e proteica foram analisadas. A identificação dos peptídeos presentes na fração peptídica do plasma, por espectrometria de massas, revelou os produtos oriundos da hidrólise de proteínas pelo HF3, e permitiu a análise dos pontos de clivagem. O efeito do HF3 sobre o plasma enriquecido de proteínas pouco abundantes também foi analisado por eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida, seguida de digestão de proteínas in gel com tripsina, e identificação das proteínas presentes em bandas diferenciais, por espectrometria de massas. Considerando todas as abordagens utilizadas neste estudo, 62 proteínas plasmáticas foram identificadas como tendo sido clivadas pelo HF3. Algumas destas proteínas corroboram estudos anteriores e outras são consideradas como candidatas a substrato desta metaloproteinase. Dentre os novos alvos, destacam-se proteínas da cascata da coagulação sanguínea e do sistema complemento, além de inibidores de proteinases, sugerindo que esta metaloproteinase pode agir de maneira desregulada, não sendo inibida pelos inibidores plasmáticos, e causando o desequilíbrio da hemostasia. A atividade do HF3 sobre as proteínas do plasma da B. jararaca foi verificada pela sua incubação com o plasma total, resultando na geração de poucos peptídeos que, no entanto, não resultaram em identificação de substratos da metaloproteinase por espectrometria de massas. Em conjunto, nossos dados reforçam achados prévios sobre o repertório de substratos do HF3 no plasma humano, apontam novos substratos e fornecem pistas para a compreensão da atividade hemorrágica do HF3