Estabilização plasmidial através da complementação do gene icdNAD e bioprodução de 1,3-propanadiol em Escherichia coli recombinante.

• Autor(a) principal: Park, Jung Hun
• Data de Publicação: 2020
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/42/42132/tde-12012022-111749/
• topic: 1,3-propanediol; 1,3-propanodiol; Escherichia coli; Escherichia coli; icd; icd; Estabilização plasmidial; NADH; NADH; Plasmid stabilization

O 1,3-propanodiol (1,3-PDO) é um componente primário para a produção de biopolímeros de alto valor agregado. Este composto pode ser produzido por algumas bactérias em microaerobiose, utilizando glicerol como fonte de carbono. Em um projeto anterior do Laboratório de Bioprodutos, uma cepa de Escherichia coli MG1655 foi transformada com um plasmídeo de produção (pBBR1MCS2 :: dha) contendo genes de K. pneumoniae (operon dha) necessários para a conversão de glicerol em 1,3-PDO. No entanto, este plasmídeo é mantido através do uso da canamicina ao meio de cultura, resultando em custos adicionais e questões de biossegurança que podem afetar a produção em larga escala. Para superar este problema, foi proposta uma estratégia de complementação do gene icd para estabilizar o plasmídeo de produção, sem a necessidade de antibióticos. O gene codifica uma Isocitrato desidrogenase NAD-dependente e é essencial para o crescimento da bactéria em meio mínimo. Este projeto teve como objetivo construir uma cepa de E. coli com o gene icd deletado em seu cromossomo, mas complementada com o mesmo gene no plasmídeo de produção. A cepa complementada com icdNAD(pJ23100) foi testada no ensaio de frasco agitado e a produção de 1,3-PDO sem antibiótico mostrou resultados promissores, produzindo a mesma quantidade de produto que a cepa de controle cultivada com antibiótico. No ensaio de biorreator, a cepa apresentou um fenótipo incomum, no qual a cultura morria ao adicionar anti-espumante e o oxigênio dissolvido (DO) no meio cair repentinamente. Apesar deste problema, uma solução foi encontrada diminuindo gradualmente a DO para atingir a microaerobiose. O rendimento de 1,3-PDO pela cepa complementada por icdNAD(pJ23100), sem antibiótico, foi comparável à cepa controle sem a complementação genética usando antibiótico. Apesar disso, foi detectada uma considerável perda de plasmídeo na população de bactérias utilizando a estratégia de complementação gênica. Portanto, uma combinação com um outro sistema de estabilização poderia aumentar ainda mais a produção de 1,3-PDO. Acredita-se que a morte da cultura de células no biorreator esteja relacionada ao aumento da produção de NADH, promovida pela super-expressão do gene icdNAD.