Estabelecimento e caracterização de um banco de células de trabalho para produção da enzima Taq DNA polimerase

• Autor(a) principal: Faria, Surian Guerios
• Data de Publicação: 2017
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UTFPR (da Universidade Tecnológica Federal do Paraná (RIUT))
• Texto Completo: http://repositorio.utfpr.edu.br/jspui/handle/1/2729
• topic: CNPQ::ENGENHARIAS::ENGENHARIA BIOMEDICA; Enzimas; Reação em cadeia de polimerase; Criopreservação de orgãos, tecidos, etc; Células; Biologia molecular; Saúde pública; Engenharia biomédica; Enzymes; Polymerase chain reaction; Cryopreservation of organs, tissues, etc; Cells; Molecular biology; Public health; Biomedical engineering; Engenharia Biomédica

O Instituto de Biologia Molecular do Paraná (IBMP) produz kits de diagnóstico para o Sistema Único de Saúde (SUS), que consistem em testes moleculares, realizados por reação em cadeia da polimerase (polymerase chain reaction - PCR). Essa reação ocorre pela atividade da enzima Taq DNA Polimerase (Taq). O IBMP fabrica a Taq a partir do cultivo de células bacterianas, em conformidade às Boas Práticas de Fabricação (BPF) e pretende produzi-la a partir de um banco de células provindas de um mesmo clone visando o aumento da homogeneidade e reprodutibilidade do processo produtivo. O objetivo do presente trabalho é estabelecer um banco de células de trabalho (BCT) e avaliar sua estabilidade para a produção da enzima Taq, partindo de um banco de células mestre (BCM) estabelecido em Bio-Manguinhos. O estabelecimento do BCT consiste em cultivar colônias do BCM, caracterizá-las, avaliar desempenho, e eleger células adequadas para compor o BCT. O estudo da estabilidade contempla testes para comprovar que as células retêm a capacidade de produzir a Taq ao longo do tempo (i.e., viabilidade celular, estabilidade plasmídica, cinética de crescimento, indução da expressão, extração e dosagem do DNA plasmidial, análise de restrição e avaliação plasmidial). O critério decisivo para a seleção de um dos clones para compor o BCT foi o resultado da cinética de crescimento. A estabilidade foi estudada em 10 avaliações realizadas mês a mês. Nelas, a viabilidade celular foi superior a 1,0 x 106 UFC/mL, mostrando que as células permanecem com capacidade de realizar seu metabolismo e reprodução. O crescimento até a fase exponencial se deu entre 6 e 7 horas de cultivo, com taxa específica de crescimento superior a 0,4 min-1 . Os cultivos acrescidos de 1 mM de IPTG expressaram a enzima Taq DNA Polimerase, revelando a qualificação das células para o fim proposto. A estabilidade plasmídica foi superior a 90%, indicando que o plasmídeo pBioMTaq se mantém estável e com boa capacidade de replicação. A concentração plasmidial média foi de 338 ng/μL, e em todos os meses foi maior que 100 ng/μL. Na análise de restrição os plasmídeos foram corretamente clivados e na avaliação plasmidial houve adequada amplificação do fragmento de 500 pb, demonstrando que o plasmídeo se mantém íntegro e estável, com sequências compatíveis com sua construção. O BCT foi testado como substrato para um processo fabril típico do IBMP de produção da Taq DNA polimerase, se apresentando satisfatório em todas as etapas em que foi avaliado. Esses resultados indicam que o banco estabelecido se manteve estável ao longo de 10 meses e está apto a ser utilizado como protótipo para um BCT em conformidade às BPF.