Desenvolvimento de processo de produ????o e caracteriza????o de interferon-??2a secretado no espa??o peripl??smico de Escherichia Coli

• Autor(a) principal: DIAS, PAULO V.S.
• Data de Publicação: 2017
• Tipo de documento: Dissertação
• Título da fonte: Repositório Institucional do IPEN
• Texto Completo: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/28422
• topic: interferon; proteins; bacteria; escherichia coli; recombinant dna; ion exchange chromatography; high-performance liquid chromatography; multiple production; mass spectroscopy; purification; site characterization

Os IFN-&alpha;2 s??o atualmente utilizados em terapia de hepatite B e C, leucemia, mieloma m??ltiplo, leucemia de c??lulas pilosas, melanoma, sarcoma de Kaposi, linfoma folicular e carcinoma de c??lulas renais, em associa????o ou n??o com outras drogas. Este trabalho descreve um processo de produ????o, purifica????o e caracteriza????o de interferon-&alpha;2a secretado para o espa??o periplasmico de E. coli utilizando um vetor baseado no uso constitutivo do promotor lambda PL. Foi validada tamb??m uma an??lise em cromatografia l??quida de alta efici??ncia em fase reversa (RP-HPLC) para monitora????o do processo. Dessa forma, este trabalho descreve inicialmente um m??todo de RP-HPLC para an??lise qualitativa e quantitativa de interferon-&alpha;2a e interferon-&alpha;2b. O m??todo foi desenvolvido e validado quanto ?? recupera????o, precis??o, linearidade, sensibilidade e especificidade. O teste de recupera????o indicou erro menor que 1 % e as determina????es quantitativas intra-dia e inter-dia apresentaram desvio padr??o relativo sempre menores que 4 %, enquanto a sensibilidade experimental foi de 0,3 &mu;g (RSD = 5 %). Em rela????o ?? linearidade, o coeficiente de correla????o assumiu o valor de 0,998 (p<0,0001), para o intervalo de massa analisada de 0,62 a 10 &mu;g de interferon. Essa metodologia permite a aplica????o de RP-HPLC como uma ferramenta poderosa para monitora????o de n??veis de express??o e qualidade do interferon-&alpha;2 durante ou logo ap??s a fermenta????o. A temperatura ??tima de express??o foi avaliada nos intervalos de 30 a 42 ??C, em cultivo em erlenmeyer. As produ????es volum??trica e espec??fica foram maiores para temperaturas iguais ou superiores a 35 ??C. Dessa forma, considerando a potencial degrada????o da prote??na recombinante induzida pela temperatura, a temperatura ??tima para a express??o de interferon neste processo foi definida como 35 ??C. Os maiores valores de produ????o espec??fica e volum??trica obtidos, em produ????o em erlenmeyer, foram 1,04 &mu;g/mL/A600 e 3,45 mg/L, respectivamente. Foi padronizado um m??todo de purifica????o laboratorial, em duas etapas: uma cromatografia de troca i??nica, seguida de uma etapa de cromatografia de exclus??o molecular. A pureza final e a recupera????o em massa foram de, respectivamente, 95,3 % e 66 %. O produto final tamb??m foi caracterizado por meio de an??lise em SDS-PAGE, western blotting, espectrometria de massas, HPLC de exclus??o molecular e HPLC em fase reversa.