Effects of different Buffy Coat processing on monocyte function

• Autor(a) principal: Rodrigues, Inês Martins Mondragão
• Data de Publicação: 2021
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: eng
• Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10773/33379
• topic: Monócitos; Células iNKT; Antigénios lipídicos; αGalCer; Buffy coat; Estado de ativação; Captação lipídica

Monócitos são leucócitos mononucleares fagolíticos circulantes com a capacidade de se diferenciarem em macrófagos, desempenhando múltiplas funções no sistema imune. Os monócitos têm sido descritos como células apresentadoras de antigénios (APC) competentes, uma vez que são capazes de adquirir, preservar e processar antigénios em tecidos periféricos e transportá-los para a zona das células T nos nódulos linfáticos, onde encontram células T cognatas. As células invariantes NKT (iNKT) são células T restritas a CD1d caracterizadas pela expressão de um TCR semi-invariante, uma vez que contém uma cadeia α invariável. Este TCR especial permite o reconhecimento de um vasto espectro de antigénios lipídicos. O antigénio protótipo usado para ativação de iNKT é a α-Galactosilceramida (αGalCer). Após a estimulação por parte do antigénio, as células iNKT rapidamente produzem grandes quantidades de citocinas. O Buffy Coat é um produto do processamento do sangue total e consiste numa unidade residual, contudo enriquecida em leucócitos. O Buffy Coat é uma fonte de células, nomeadamente monócitos, que está disponível diariamente para utilização em investigação. De acordo com o intervalo de tempo entre a colheita e o processamento da dádiva de sangue, os Buffy Coats são processados por dois protocolos distintos dando origem a: Buffy Coats processados em sangue fresco (Fresh Blood), em que a colheita e o processamento ocorrem no mesmo dia; ou Buffy Coats processados em sangue de pernoite (Overnight) onde o processamento do sangue total só ocorre no dia seguinte à colheita. Esta tese tem como objetivo avaliar se as diferenças no tempo de processamento de Buffy Coats poderão ter impacto na viabilidade, no fenótipo e na função dos monócitos. Em particular, a função dos monócitos como célula apresentadora de antigénios foi investigada. Como CD1d é uma molécula apresentadora de antigénio não polimórfica, ao contrário das moléculas HLA altamente polimórficas, a apresentação de antigénios lipídicos (αGalCer e α-GalGalCer) a células iNKT restritas a CD1d foi avaliada. Foram analisados Buffy Coats com diferentes tempos de processamento e diferentes tempos de espera nomeadamente: Buffy Coat processado em Fresh Blood e que aguardou 24h para ser analisado; Buffy Coat processado em Overnight que esperou 0h para ser analisado e Buffy Coat processado em Fresh Blood que esperou 48h pelos ensaios. Os ensaios de ativação realizados levaram à conclusão de que os monócitos provenientes de Buffy Coats processados em Fresh Blood e que esperam 24h para ser analisados têm uma melhor capacidade de ativar células iNKT do que aqueles que advêm de Buffy Coats processados em Overnight e que esperam 0h para serem analisados. Esta diferença não pode ser justificada por diferenças na viabilidade dos monócitos, nem pela expressão à superfície de CD1d ou pelo estado de ativação apurado pela expressão à superfície de CD40 e CD80 quando comparados os Buffy Coats processados em tempos distintos. Tendo em conta estas diferenças, foi investigado se o aumento do tempo de espera para o ensaio de ativação se poderia traduzir numa melhor capacidade de apresentar antigénios lipídicos por parte dos monócitos. Foi verificado que a capacidade de apresentação de antigénios por parte dos monócitos de Buffy Coats processados em Fresh Blood que aguardam 48h não supera a capacidade de ativar iNKT pelos monócitos de Buffy Coats processados em Fresh Blood que esperam 24h pelas experiências. Com o objetivo de tentar explicar as diferenças na capacidade de apresentação de antigénios lipídicos por parte dos monócitos isolados dos Buffy Coats com diferentes tempos de processamento, analisou-se a expressão de genes associados à ativação de monócitos ou genes importantes para a apresentação de antigénios. Não foram observadas diferenças na expressão dos genes IL-6, IL-8, IL12p-40, IL-18 e XBP1s entre os monócitos de Buffy Coats processados em Fresh Blood que esperam 24h para serem analisados e os monócitos de Buffy Coats processados em Overnight que aguardam 0h para serem analisados. Monócitos provenientes de Buffy Coats processados em Fresh Blood que aguardam 48h até serem analisados tiveram maior expressão dos genes IL-6 e IL-18 quando comparados aos monócitos de Buffy Coats processados em Overnight que esperam 0h para serem analisados. Ainda foi realizada a ativação de monócitos com Lipopolissacarídeo (LPS) para avaliar se as diferenças observadas na capacidade de ativação das iNKT por monócitos dos diferentes Buffy Coats também seriam observadas ao usar um estímulo mais geral como o LPS. Os resultados mostram que a capacidade de ativar células iNKT e a ativação com LPS podem estar relacionadas, mas mais experiências são necessárias para obter conclusões mais fiáveis. Além disso, colocou-se a hipótese de que as diferenças na capacidade de ativação de células iNKT demonstradas pelos monócitos provenientes de dois tipos de Buffy Coats poderiam dever-se a diferentes capacidades de captação do antigénio lipídico. Para testar esta hipótese, monócitos foram incubados com αGalCer fluorescente (αGalCer-BODIPY) e a captação de αGalCer pelos monócitos foi quantificada por citometria de fluxo. Quatro experiências foram realizadas, mas os resultados não mostraram uma diferença clara na captação de αGalCer entre monócitos dos dois tipos de Buffy Coats que justificassem as diferenças observadas na capacidade de ativação de iNKT. Esta tese contribui para uma melhor caracterização dos monócitos isolados de Buffy Coats. Este trabalho indica que os diversos protocolos de processamento de Buffy Coats influenciam as funções dos monócitos como APC. Os resultados mostram que monócitos de Buffy Coats processados em Fresh Blood que esperam 24h têm melhor capacidade de ativar células iNKT. Portanto, o tipo de protocolo para o processamento de Buffy Coats deve ser cuidadosamente considerado na investigação diária, uma vez que pode levar a resultados diferentes.