Development of a bacterial biomimetic system for liver drug metabolism

• Autor(a) principal: Cruz, Josimar Pires da
• Data de Publicação: 2021
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10400.26/37610
• topic: Proteínas recombinantes; Clonagem de cDNA; Expressão de proteínas; Purificação de proteínas; Biologia molecular; Recombinant proteins; cDNA cloning; Protein expression; Protein purification; Molecular biology

A avaliação da segurança de fármacos, quer durante a fase clínica quer durante as fases iniciais do desenvolvimento de novos fármacos, é um processo fundamental para o despiste de potenciais efeitos tóxicos. Os fármacos pertencem ao grupo dos xenobióticos - compostos estranhos ao organismo que serão extensivamente metabolizados a fim de diminuir sua toxicidade para o organismo humano. O metabolismo de fármacos envolve vários sistemas enzimáticos, e dois dos mais importantes são os citocromos P450 (CYP), uma família de oxidorredutases hémicas que catalisam vários tipos de reações, e as sulfotransferases (SULT), uma família de enzimas capazes de catalisar a sulfonação de grupos hidroxilo. Uma das abordagens para prever o metabolismo de fármacos é o desenvolvimento de reatores enzimáticos que permitem replicar o metabolismo in vivo. Com esta abordagem em mente, várias proteínas da família dos CYPs e das SULTs humanas foram subclonadas num vetor de expressão estável para permitir a sobreprodução em Escherichia coli competente para expressão. O objetivo foi obter as proteínas purificadas para serem utilizadas numa linha de investigação que visa co-imobilizar essas proteínas e desenvolver um reator enzimático in vitro. A isoforma SULT1A1 e as isoformas CYP 2D6 e 3A4 foram clonadas no vetor pET28a (+) por amplificação por PCR dos cDNAs presentes em vetores disponíveis comercialmente usando primers desenvolvidos para introduzir locais de corte para enzimas de restrição. A isoforma CYP2C8 foi subclonada a partir do vetor disponível por excisão com enzimas de restrição adequadas e transferida para o vetor pET28a (+). A isoforma SULT1B1 já estava disponível no vetor desejado. Todas as proteínas foram expressas como proteínas de fusão apresentando uma cauda His6 N-terminal para facilitar a purificação e, a jusante, a imobilização das proteínas. Todas as proteínas, com exceção do CYP 3A4, foram sobre-expressas com sucesso em E. coli, com bandas de absorvância nos cromatogramas de purificação indicando a existência de proteínas marcadas com histidina. No entanto, em alguns casos, a quantidade de proteína produzida era muito baixa. Não foi possível obter um plasmídeo estável com o CYP 3A4, provavelmente porque a baixa especificidade de substrato deste enzima, associada ao comportamento leaky característico do promotor T7 presente no vetor pET28a (+), leva a um ambiente tóxico nas células.