Breast cancer brain metastasization: new players and potential biomarkers
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| Data de Publicação: | 2019 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | eng |
| Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10451/44269 |
Resumo: | Tese de mestrado, Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2020 |
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Breast cancer brain metastasization: new players and potential biomarkersMetástases cerebrais de cancro da mamaExtravasamentoComunicações intercelularesBiomarcadoresMEF2CTeses de mestrado - 2020Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências BiológicasTese de mestrado, Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2020Com as recentes melhorias nos tratamentos do cancro da mama, as metástases cerebrais tornaram-se uma grande preocupação na área de oncologia. Visto que não há meios de diagnóstico precoce e as metástases são detetadas apenas quando surgem os primeiros sintomas neurológicos, o cancro metastático tornou-se a principal causa de morte nos doentes de cancro da mama, conferindo-lhes um pior prognóstico. Deste modo, é essencial um melhor esclarecimento de todo o processo metastático cerebral de forma a se poder descobrir novos alvos de modulação e potenciais biomarcadores que permitam a deteção precoce das metástases no encéfalo. O tal processo metastático exige a transmigração das células cancerígenas através da barreira hematoencefálica, uma estrutura composta por juncões intercelulares, incluindo as junções comunicantes, hemidesmossomas e adesões focais. As junções comunicantes são constituídas maioritariamente por conexinas e são responsáveis pela comunicação entre células adjacentes, enquanto os hemidesmossomas e as adesões focais permitem a ancoragem das células endoteliais (ECs) à membrana basal e são formadas principalmente por integrinas e pela proteína cinase de adesão focal (FAK), respetivamente. Após o extravasamento e à medida que se formam as metástases, as células tumorais sofrem uma completa ou parcial transição mesenquimal-epitelial para adquirirem um fenótipo epitelial que recapitula o de origem. Sabe-se que a progressão metastática induz uma expressão aberrante de microRNAs (miRNAs ou miRs) e a libertação de vesículas extracelulares (EVs), s que têm sido sugeridos como potenciais biomarcadores de doenças oncológicas. Devido à sua especificidade, estabilidade e fácil quantificação em fluidos biológicos, como o plasma, é possível usar um método não invasivo, como as biópsias líquidas, no diagnóstico e prognóstico de doenças oncológicas. Estudos prévios realizados pela nossa equipa mostraram uma expressão aberrante de um conjunto específico de miRNAs, incluindo miR-802-5p e o miR-92a-1-5p, no plasma de ratinhos antes da formação de metástases cerebrais de cancro da mama triplo negativo (TN). Posteriormente, através de uma análise bioinformática de previsão de alvos destes miRNAs, o fator intensificador de miócitos 2C (MEF2C) surgiu como um alvo interessante de ambos. A expressão deste fator de transcrição foi observada em células malignas isoladas e em metástases cerebrais com um aumento da sua translocação nuclear em estadios mais avançados do desenvolvimento tumoral. Estudos descreveram que tal translocação promove a transcrição de vários genes associados a vias de sinalização tumorais, como é o caso do gene fator de crescimento endotelial vascular (vegf). Foi ainda descrito que o MEF2C nuclear induz a formação de novos vasos e a migração tumoral através da via de sinalização VEGF enquanto o MEF2C citosólico bloqueia a sinalização Wnt/ß-catenina, inibindo o crescimento tumoral. Portanto, tendo em conta todas estas informações, nesta tese propomos testar a hipótese de que o extravasamento das células do cancro da mama e a sua colonização no encéfalo induzem alterações nas proteínas das junções comunicantes, dos hemidesmossomas e das adesões focais e no fenótipo das células tumorais, e promovem a expressão alterada de miR-802-5p e miR-92a-1-5p no parênquima encefálico bem como a libertação de EVs para a corrente sanguínea. Além disso, propomos ainda avaliar a expressão de MEF2C em amostras de metástases cerebrais humanas provenientes de pacientes com cancro da mama. Com este intuito, inocularam-se ratinhos com células 4T1 ou com solução salina, como controlo, sacrificando os ratinhos e colhendo os seus encéfalos a diferentes tempos após inoculação (5 horas, 3, 7 e 10 dias). As análises do parênquima encefálico foram determinadas por ensaios de imunofluorescência da expressão de conexina 43 (Cx43), FAK, ß4 integrina, subunidade da α6ß4 integrina, dos marcadores mesenquimais (neural caderina, N-caderina) e de astrócitos (proteína fibrilar ácida da glia, GFAP) assim como por ensaios de hibridização in situ do miR-802-5p e de miR-92a-1-5p. O plasma também foi analisado relativamente à presença de EVs através do NanoSight. Além disso, para o estudo do MEF2C, foram realizados estudos de imunofluorescência de amostras de metástases cerebrais humanas provenientes de pacientes com cancro da mama. Foi observada a expressão da proteína das junções comunicantes, Cx43, nos locais de contacto entre ECs e células malignas durante o extravasamento e, posteriormente, entre células malignas já em metástases formadas. Astrócitos reativos, identificados pela expressão de GFAP, também apresentaram expressão de Cx43, presumivelmente devido à resposta inflamatória. Estes resultados demonstram o papel das junções comunicantes na promoção da comunicação entre células tumorais e o microambiente encefálico permitindo a sua proliferação e sobrevivência. Em relação aos hemidesmossomas e adesões focais, a expressão de FAK foi observada nas células endoteliais, aumentando durante o extravasamento. As células malignas também exibiram um impressionante aumento de expressão tanto de FAK como de ß4 integrina, indicando o envolvimento da sinalização mediada pelo complexo integrina/FAK no desenvolvimento de metástases. Além disso, observou-se que as células malignas sofreram uma transição mesenquimal-epitelial pois apresentam uma diminuição da expressão do marcador mesenquimal, N-caderina, seguida de um aumento da expressão de proteínas associadas ao fenótipo epitelial como a lectina e a pan citoqueratina durante os estadios mais avançados do tumor cerebral de cancro da mama. Durante o processo de extravasamento ocorreu um aumento da quantidade de EVs secretadas para o plasma, sugerindo um papel destas vesículas na comunicação entre as células e os seus alvos, promovendo, assim, a tumorigénese. Como mencionado anteriormente, a expressão dos miR-802-1-5p e miR-92a-1-5p encontrava-se desregulada no plasma dos ratinhos durante os estadios inicias do cancro da mama metastático. O miR-802-5p e miR-92a-1-5p apresentavam os seus níveis de expressão diminuídos e aumentados, respetivamente, na fase que antecede a formação de metástases, evidenciando o seu potencial como biomarcadores da doença oncológica metastática. O mesmo padrão da expressão destes dois miRNAs foi observado nas células cerebrais ao longo da progressão tumoral, o que sugere que as células cerebrais poderão estar a modular as expressões destes miRNAs de forma a criar um ambiente favorável à formação de tumores. Uma semelhante sobreexpressão do MEF2C foi observada nas amostras humanas, porém vários padrões da marcação do MEF2C consoante a sua localização celular foram detetados. Isto levou a uma categorização dos pacientes em três fenótipos diferentes: marcação extracelular de MEF2C, fenótipo 1; 50% das células com localização extranuclear e 50% das células tanto com marcação extranuclear como nuclear, fenótipo 2; marcação de MEF2C pela célula toda, fenótipo 3. Verificou-se também que a translocação nuclear deste fator de transcrição está associada ao aumento de tamanho e do número de metástases cerebrais e, consequentemente à progressão da doença. Também se observou um aumento do recetor 2 do VEGF (VEGFR-2) nos casos que apresentam o fenótipo 1, o que aponta para uma possível promoção da expressão de MEF2C através da via de sinalização de VEGF/VEGFR-2. Em relação aos casos com o fenótipo 3, observou-se um aumento da ß-catenina nuclear e Ki-67, um marcador da proliferação, nas células malignas, sugerindo, assim, um potencial papel do MEF2C na progressão tumoral pela via de sinalização Wnt/ß-catenina. Este fator de transcrição foi ainda estudado em amostras humanas de tumor primário, revelando a expressão do MEF2C em células tumorais com caraterísticas mesenquimais localizadas fora do ducto mamário que possivelmente estariam a invadir e a migrar para a corrente sanguínea. Em suma, este trabalho demonstrou que ao longo da migração transendothelial das células tumorais pela barreira hematoencefálica e da colonização das mesmas no encéfalo, ocorrem alterações tanto nas proteínas de junção como no fenótipo das células malignas. Tudo isto permitiu esclarecer alguns eventos celulares e moleculares que acontecem durante a progressão metastática, evidenciando novos alvos com potencial para modulação com vista à inibição da formação e desenvolvimento de metástases. Este estudo também corroborou o potencial do miR-802-1-5p e do miR-92a-1-5p como potenciais biomarcadores do tumor metastático proveniente do cancro da mama, e revelou ainda as EVs como outros potencial biomarcadores com potencial utilidade no diagnóstico de metástases cerebrais. Por último, o MEF2C surge como um possível biomarcador de prognóstico do cancro mama e um potencial alvo de modulação para o desenvolvimento de novas terapias para as metástases cerebrais provenientes do cancro da mama.With the growing improvement of breast cancer (BC) therapies, brain metastases have become a major problem. Until today, there are no means of early diagnosis and metastases are only detected when the first neurologic problems appear, which account for the poor prognosis of BC patients. Therefore, there is an unmet need for better clarification of the brain metastasization process in order to discover new key players for modulation and potential biomarkers of brain metastases development. The brain metastasization requires the transmigration of cancer cells through the blood-brain barrier (BBB), which is characterized by elaborate intercellular junctions including gap junction (GJ), hemidesmosomes and focal adhesions. GJ is responsible for the communication between adjacent cells, while hemidesmosomes and focal adhesions anchor the endothelial cells (ECs) to the basement membrane. Upon extravasation, the cancer cells undergo a complete or partial mesenchymal-epithelial transition (MET) to acquire the epithelial phenotype that allows them to establish and form metastases. It is known that metastatic progression induces the aberrant expression of microRNAs (miRNAs or miRs), and the release of extracellular vesicles (EVs), which suggests them as potential biomarkers for cancer detection. Previous studies from our lab in a mouse model of brain metastasization from triple negative BC (TNBC) showed a downregulation of miR-802-5p and upregulation of miR-92a-1-5p in plasma prior to brain metastases detection. Further, myocyte enhancer factor 2C (MEF2C) appeared as an interesting target of the altered miRNAs, presenting a nuclear translocation at late stages of brain metastasization, associated to the transcription of several genes related to cancer signalling pathways as vascular endothelial growth factor (VEGF) and Wnt/β-catenin. Therefore, we hypothesized that the BC cells (BCCs) extravasation and colonization may induce alterations in proteins of GJs, hemidesmosomes and focal adhesions such as connexin 43 (Cx43), α6β4, integrin and focal adhesion kinase (FAK), respectively, and promote the aberrant expression of miR-802-5p and miR-92a-1-5p in brain parenchyma as well as the release of EVs into the bloodstream. In parallel, we aimed to assess the MEF2C expression in patients’ BC brain metastases (BCBM) and relate it with VEGF and Wnt/β-catenin signalling pathways. To this end, brain and plasma samples were collected from vehicle (control) and 4T1 cells-injected mice, at different timepoints during the metastatic progression (5 hours, 3, 7 and 10 days) for immunofluorescence (IF), in situ hybridization (ISH) and Nanoparticle tracking analysis (NTA). Moreover, for the MEF2C study, IF analysis of resected brain metastases from BC patients was performed. During brain metastasization, it was observed the expression of Cx43, at malignant-ECs’ contacts as early as malignant cells were extravasating, and later at malignant-malignant cells contacts, reflecting a role of intercellular communication along tumour progression. Reactive astrocytes also expressed Cx43 probably due to an inflammatory response. Both ECs and BCCs presented FAK expression during tumour development. The β4 integrin, a subunit of α6β4 integrin, was also impressively overexpressed in malignant cells, indicating the involvement of integrin-mediated signalling as a key player in metastasis development. Moreover, the BCCs underwent a MET by presenting a decreased expression of a mesenchymal maker, neural-cadherin (N-cadherin) followed by an increased expression of epithelial markers as pan Cytokeratin at late stages of tumour development. During the extravasation process, it occurred an increasing release of EVs into the plasma, which suggests their potential as a biomarker of BCBM. In line with the altered pattern of miRNAs in plasma, a decreased expression of miR-802-5p and an increased presence of miR-92a-1-5p were observed in the brain parenchyma along BCBM development, indicating their putative role as a disease biomarker. A similar MEF2C overexpression was observed in humans BCBM, although several MEF2C cellular locations were detected. This led to the categorization of patients in three putative phenotypes (P): P1, with an extranuclear location of MEF2C; P2, where 50% cells presented only extranuclear location and 50% presented nuclear staining; and P3, where all cells presented a nuclear location of MEF2C. MEF2C nuclear translocation showed to be associated with disease severity. Moreover, P1 presented a higher VEFGR-2 immunoreactivity, suggesting that the VEGF signalling may promote the MEF2C expression. Regarding the P3, it was observed an increase in ß-catenin nuclear- and Ki-67-positive cancer cells, pointing to the potential role of MEF2C in the tumour progression through Wnt/ß-catenin signalling. Human primary BC samples also presented MEF2C expression, showing its importance in the first steps of the metastatic cascade. Altogether, these results allowed the clarification of several cellular and molecular events, highlighting potential targets for modulation in order to prevent metastasis formation and development. Besides, the discovery of miR-802-5p, miR-92a-1-5p and EVs as specific biomarkers of BCBM, will be useful for BCBM future diagnostic and the development of effective therapies. It also revealed MEF2C as an emerging biomarker of BC prognosis as well as its potential as a target for modulation in order to abrogate BCBM development.Brito, Maria Alexandra,1960-Caeiro, Filomena,1950-Repositório da Universidade de LisboaGalego, Sofia Raquel Néné2022-12-31T01:31:03Z202020192020-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/44269TID:202476847enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:45:12Zoai:repositorio.ul.pt:10451/44269Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:56:53.560245Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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