Expressão heteróloga da forma selvagem e mutante da piruvato desidrogenase humana (hPDHE1): efeito de chaperones químicos

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Florindo, Cristina Isabel Pereira
Data de Publicação: 2010
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/8597
Resumo: Tese de mestrado em Bioquímica (Bioquímica Médica), apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2010
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Uma alteração na actividade deste enzima da origem a deficiência em PDH, um erro hereditário do metabolismo que pode causar um quadro clinico grave que inclui acidose láctica e alterações neurológicas profundas. No decorrer do processo de diagnóstico da deficiência em PDHc foi identificada, numa criança Portuguesa, a mutação c.757A>G no gene que codifica a subunidade α do enzima E1 e que corresponde a mutação R224G na proteína madura. Apos administração de AspartenR (aspartato de arginina) observou-se uma reversão do quadro clinico acompanhado laboratorialmente por uma normalização da actividade do PDHc e da produção de E1α. Assim, com o objectivo de elucidar a base molecular do efeito observado foi optimizado um sistema de expressão bicistrónico para co-produção e purificação das subunidades α e β da proteína E1. A hE1 selvagem (hE1αwt/hE1βwt) e a forma mutante hE1αR224G/hE1βwt foram posteriormente expressas na presença e ausência de arginina ou aspartato e caracterizadas. Na ausência de arginina ou de aspartato a proteína mutante hE1αR224G/hE1βwt apresentou 47% de actividade residual, pelo que esta mutação pode ser considerada como causadora de doença. Quando o enzima mutante e produzido na presença de arginina observou-se um aumento da proteína na fracção solúvel e um incremento da sua actividade enzimática residual (145%). Estes resultados sugerem que a mutação R224G na proteína E1α podera dar origem a um enzima conformacionalmente alterado, que será rapidamente degradado pelo sistema de controlo de qualidade proteica intracelular. A presença do aminoácido arginina, considerado um agente estabilizante, poderá modular o folding daquela proteína mutante e deste modo contribuir para o aumento da sua actividade.The piruvate dehydrogenase complex (PDHc) is a multienzymatic system localized in the mitochondrial matrix that plays an essential role in glucose metabolism by being responsible for the oxidative decarboxilation of pyruvate to acetyl-CoA. The pyruvate dehydrogenase protein (E1; EC 1.2.4.1) is one of the PDHc components and catalyzes the rate limiting step of the overall complex. The E1 component (EC 1.2.4.1) is a heterotetramer of two α and two β chains (α2 β2). A deficient activity of this enzyme leads to PDHc deficiency, an inborn error of metabolism that causes a severe lactic acidosis and profound neurological defects. Recently, our group identified, in a Portuguese boy presenting PDHc deficiency, a novel c.757A>G mutation in the gene encoding the E1α subunit which corresponds to the R224G in the mature protein. Biochemical re-evaluation after AspartenR (arginine aspartate) intake showed a recovery of PDHc activity and a normal pattern of E1α protein. Therefore, in order to elucidate the molecular basis of the observed effect a bicistronic expression system was developed to co-produce and purify the E1 α and β subunits. The E1 wild-type (hE1αwt/hE1βwt) and mutant protein (hE1αR224G/hE1βwt) were then expressed in the absence and presence of ariginine or aspartate and further characterized. In the absence of arginine or aspartate the mutant hE1αR224G/hE1βwt protein presented only 47% of residual enzymatic activity indicating that this mutation is a disease-causing mutation. When the mutant enzyme was produced in the presence of arginine, an increase in the amount of the protein present in the soluble fraction, as well as an increment in residual enzyme activity (145%) was observed. The obtained data strongly suggest that the R223G mutation in the E1 α subunit will induce conformational changes in the mutant enzyme, which will be recognized and degraded by the intracellular protein quality control system. Arginine, a postulated protein stabilizer, would restore the correct folding of the mutant E α subunit thus normalizing its enzymatic activity.Leandro, PaulaFarinha, Carlos Miguel Ribeiro da Silva, 1973-Repositório da Universidade de LisboaFlorindo, Cristina Isabel Pereira2013-05-30T11:22:28Z20102010-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/8597porinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T15:52:27Zoai:repositorio.ul.pt:10451/8597Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:33:02.895487Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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