Investigating cellular and molecular neuroendocrine signalling in the diabetic gut

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Mira, Miguel Ângelo de Freitas
Data de Publicação: 2021
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/51325
Resumo: Tese de Mestrado, Biologia Molecular e Genética, 2021, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências
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spelling Investigating cellular and molecular neuroendocrine signalling in the diabetic gutDomínios de tetramerização dos canais de potássioGlia entéricaIdadePré-diabetesSistema nervoso entéricoTeses de mestrado - 2021Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências BiológicasTese de Mestrado, Biologia Molecular e Genética, 2021, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasA glucose é um dos monossacarídeos mais importantes para a vida, uma vez que o nosso organismo a utiliza como uma fonte de energia indispensável ao funcionamento normal dos vários órgãos e tecidos que dela precisam. Para que esse uso aconteça, é necessário que a glucose passe da corrente sanguínea para o interior das células, sendo que esse transporte é possível graças a uma substância química concebida pelo organismo: a insulina. A insulina é uma hormona produzida pelas células β pancreáticas das ilhotas de Langerhans que é libertada das mesmas quando os níveis de “açúcar” na corrente sanguínea se encontram elevados. Contudo, na diabetes mellitus (DM), esta situação está alterada. A DM é uma doença crónica caracterizada pelo aumento desregulado dos níveis de glucose no sangue, fenómeno designado por hiperglicemia, e pela incapacidade do organismo em transportar toda a glucose proveniente dos alimentos, levando a um desequilíbrio nos seus níveis sanguíneos. Nos últimos dez anos, o impacto do envelhecimento da estrutura etária da população portuguesa (20-79 anos) levou a um aumento de cerca de dois pontos percentuais na taxa de prevalência da DM entre 2009 e 2018, o que equivale a um crescimento de cerca de 16,3%. Mundialmente, em 2019, 463 milhões de pessoas tinham DM (9,3% da população até à data), sendo que 134 milhões se encontravam entre os 65 e os 99 anos (19,4% da população contida nessa faixa etária). Em Portugal, a prevalência nessa faixa etária fixava-se nos 24%. Estima-se que essas prevalências cresçam a um ritmo alarmante, o que leva a que a DM seja considerada uma grande ameaça mundial para a saúde pública. O tipo mais comum de DM, a DM tipo 2 (T2DM), que ocorre em cerca de 90% da população mundial com DM, e cuja prevalência é mais elevada em indivíduos mais envelhecidos, resulta, numa fase inicial (pré-diabetes), de uma anomalia nos níveis de glucose em jejum e de uma intolerância a este carbohidrato. Após vários anos, as células do nosso organismo ficam incapazes de responder de forma correta à insulina, induzindo-se uma resistência a esta hormona que levará a um aumento nos seus níveis de produção, e eventualmente, à incapacidade das células β em compensar este desequilíbrio. Tudo isto provocará a ocorrência de complicações macrovasculares, tais como doença coronária e hipertensão arterial, e microvasculares, nomeadamente retinopatia e neuropatia, que podem causar complicações severas que diminuirão drasticamente a qualidade e esperança média de vida dos indivíduos com T2DM. Os tipos de cirurgia bariátrica são divididos em três grupos: 1) os principalmente restritivos, que incluem a banda gástrica ajustável e a gastrectomia vertical, e que diminuem a quantidade de alimentos ingeridos por diminuição do volume gástrico, 2) os principalmente disabsortivos, como a derivação biliopancreática e o duodenal switch, em que a perda de peso é altamente eficaz, uma vez que reduzem o trajeto no qual os nutrientes vão ser absorvidos, e 3) os que usam uma combinação de ambas as técnicas, também designados por procedimentos mistos, como é o caso do bypass gástrico em Y de Roux (RYGB). No RYGB, é criada uma pequena bolsa gástrica com cerca de trinta mililitros de capacidade que é ligada ao intestino delgado ao nível do jejuno, pelo que as regiões do intestino delgado proximal (i.e., duodeno e início do jejuno) nunca sofreriam a ação das secreções pancreática e biliar. Contudo, e completamente por acaso, a regressão da T2DM que se observou dias após este bypass gástrico colocam em evidência o intestino delgado proximal como um dos principais intervenientes da etiologia desta doença. Modificações dos níveis hormonais, principalmente ao nível do péptido semelhante ao glucagão 1 (GLP-1), e do microbioma intestinal têm sido estudadas para explicar esta regressão, mas os mecanismos moleculares subjacentes permanecem inconclusivos. Em condições normais, os processos de sinalização ao nível da parede intestinal que ocorrem em resposta a certos nutrientes ingeridos envolvem enterócitos, células enteroendócrinas (EEC’s), e uma rede de glias entéricas, nervos intrínsecos e extrínsecos que comunicam com o sistema nervoso central (CNS) e com o periférico. Para que haja propagação do sinal, é necessário que um neurónio pré-sináptico seja capaz de gerar e propagar um potencial de ação através do seu axónio, transmitindo-o por uma sinapse mediante a libertação de neurotransmissores. Esses neurotransmissores irão potenciar uma reação num neurónio pós-sináptico ou numa célula efetora, tais como as células musculares e a maioria das células exócrinas e endócrinas. Ao nível do CNS dos mamíferos em desenvolvimento, o principal neurotransmissor inibitório corresponde ao ácido γ-aminobutírico [nome IUPAC: ácido 4-aminobutanoico (GABA)], neurotransmissor esse que se encontra presente nos nervos entéricos e em EEC’s intestinais. Como tal, a neurotransmissão mediada pelo GABA considera-se envolvida 1) na regulação das funções fisiológicas ao nível do trato gastrointestinal, e 2) como sendo um mediador enteroendócrino que influencia a função desse trato. O GABA exerce a sua função através da ligação aos respetivos recetores, podendo os mesmos ser classificados em ionotrópicos (GABAA) ou metabotrópicos (GABAB). Dos dois, a informação relacionada com o recetor GABAB (GABABR) é a mais escassa, visto que 1) estes recetores foram dos últimos a ser caracterizados a nível molecular, e 2) apenas dois derivados agonísticos do GABA, baclofeno e ácido γ-hidroxibutirato, são capazes de se ligar ao lado ortostático da estrutura deste recetor. Contudo, os seus efeitos secundários, tais como dormência e tonturas, levam a que a administração destes derivados seja desfavorável em muitos casos de patologia. A nível molecular, os GABABRs consistem em duas subunidades, GABABR1 e GABABR2, sendo que o GABABR2 é também importante para o acoplamento das proteínas G, cuja sinalização é regulada por homo-oligómeros de subunidades auxiliares, aos quais se dá o nome de domínios de tetramerização dos canais de potássio (KCTD’s). KCTD8, KCTD12 e KCTD16 pertencem ao clado F de uma grande família de vinte e cinco proteínas humanas KCTD que atuam especificamente com os GABABR, regulando vias intracelulares a jusante via o acoplamento a proteínas G, nomeadamente os canais de iões cálcio dependentes de voltagem, os canais de iões potássio, e o adenilato ciclase. Mais concretamente, as proteínas KCTD interagem com um resíduo de tirosina-902 presente no terminal-C do domínio intracelular da subunidade GABABR2. No entanto, a distribuição do GABABR2 com estas proteínas específicas ao nível do duodeno e do início do jejuno, assim como o possível papel dessa interação no envelhecimento ou na progressão da T2DM, ainda são desconhecidas. Neste estudo, procedeu-se à extração do intestino delgado proximal proveniente de murganhos masculinos C57BL/6J que foram usados como modelos de envelhecimento e de pré-diabetes induzida por uma dieta rica em gordura (HFD). Esta região intestinal foi estudada sob a forma de secções do duodeno ou de rolinhos intestinais, secções essas que foram analisadas mediante dois ensaios imuno-histoquímicos: ligação por proximidade (PLA) e imunofluorescência (IF), que permitiram investigar a co-localização das proteínas KCTD com a subunidade GABABR2, e apenas IF, para analisar os níveis de expressão dos KCTD ao nível das células não gliais (presumivelmente neurais) e gliais marcadas com a proteína ácida fibrilar glial (GFAP), um dos melhores marcadores para simbolizar a ativação da glia entérica após situações de danos estruturais ou de stress ao nível do sistema nervoso entérico. Estas análises imuno-histoquímicas foram efetuadas na porção interior das vilosidades intestinais, à qual se dá o nome de lâmina própria. Os resultados obtidos por PLA e por IF demonstraram que, nos murganhos HFD, a expressão das proteínas KCTD8 e KCTD16 co-localizadas com o GABABR2 decresceu na ordem das 0.4 e 0.6 vezes respetivamente, quando comparada com os murganhos alimentados com uma dieta normal (NCD). No entanto, nos murganhos envelhecidos (20 meses de idade), todos os KCTD co-localizados com esta subunidade sofreram um aumento de cerca de 1.0 a 2.5 vezes na sua expressão, quando comparada com os murganhos jovens (4 meses). Estes resultados indicam que a sinalização potenciada pelo GABABR e dependente do KCTD8 e do KCTD16 sofre uma disrupção independente da idade em casos de pré-diabetes. Os estudos de IF revelaram que as células gliais que não expressam as proteínas KCTD sofreram um aumento geral da sua expressão em todos os murganhos, o que é indicativo de uma maior inflamação intestinal com a idade e com a pré-diabetes. Nas células não gliais (presumivelmente células neurais), observou-se um aumento de 50 vezes na expressão do KCTD12 ao nível dos murganhos HFD, e um decréscimo de 0.7 vezes para o KCTD16 nos murganhos envelhecidos. Finalmente, a expressão de todos os KCTD estudados ao nível das células gliais aumentou em todos os murganhos envelhecidos, mas decresceu 0.6 vezes para o KCTD16 nos murganhos HFD. A partir destes resultados, podemos inferir que a sinalização mediada pelo GABABR ao nível do intestino delgado proximal sofreu uma disrupção independente da idade ao nível dos modelos pré-diabéticos, sendo que a glia entérica, quando co-localizada com o KCTD16 (decréscimo nos seus níveis), pode estar envolvida nessa disrupção. Para além disso, o KCTD12 em células não gliais, pelo facto de apresentar uma expressão aumentada significativamente em condições pré-diabéticas, pode ser considerado, juntamente com o KCTD16, como um potencial alvo farmacológico para estudar a prevenção desta doença crónica.Diabetes mellitus (DM) is a chronic disease characterized by hyperglycaemia and glucose intolerance. By 2019, 463 million people worldwide (9.3%) suffered from this disease. Type 2 diabetes mellitus (T2DM) accounts for about 90% of all DM cases, with higher prevalence in aged populations. This disease is characterized, at early stages (prediabetes), by impaired fasting glucose and glucose intolerance, and after several years, by insulin resistance, hyperglycaemia, and eventually impaired insulin secretion, leading to serious health complications. Current treatments only serve to regulate hyperglycaemia and attenuate progression of T2DM. However, by chance, remission of T2DM was observed within days after bariatric surgery involving duodenal/jejunal gut bypass, pointing to those bypassed regions as major culprits in its aetiology. Changes in gut hormones and gut microbiome could explain this observed remission, but the molecular mechanisms underlying it remain inconclusive. Gut signalling in response to ingested nutrients involves enterocytes, diverse enteroendocrine cells (EECs), and networks of enteric glia, intrinsic and extrinsic nerves that communicate with the peripheral and central nervous systems. γ-aminobutyric acid (GABA), the main inhibitory neurotransmitter, is present in enteric nerves and EECs, implicating GABA-mediated neurotransmission in the regulation of physiological functions within the gastrointestinal tract. GABA mediates its effects via GABA receptors, including the heterodimeric and metabotropic GABAB receptors (GABABR), whose G protein signalling is regulated by homo-oligomers of auxiliary subunits termed potassium channel tetramerization domains (KCTDs). KCTD8, KCTD12 and KCTD16 function specifically with GABABR2, regulating downstream intracellular pathways via G protein coupling, including voltage-gated calcium ion channels, potassium ion channels, and adenylyl cyclase. However, the distribution of GABABR2 with specific KCTDs in the gut and their role in ageing or T2DM progression is still unknown. We extracted the proximal small intestine of young, old, and high-fat diet-induced prediabetic (HFD) C57BL/6J male mice, and used proximity ligation assay (PLA) and immunofluorescence (IF), to investigate KCTD proteins colocalized with GABABR2, and IF-only, to investigate KCTD expression in non-glial (presumed neural cells) and glial cells, in the interior of intestinal villi. PLA and IF results showed that expression of KCTD8 and KCTD16 colocalized with GABABR2 in HFD mice declined 0.4 and 0.6-fold respectively, when compared to mice on a normal chow diet (NCD). However, in old mice, all KCTDs colocalized with GABABR2 had a 1.0 to 2.5-fold increase, compared to young mice. These results reveal an age-independent disruption of KCTD8 and KCTD16 GABABR signalling in prediabetes. IF studies revealed that glial cells not expressing KCTDs were increased overall in both old and HFD mice, indicating enhanced gut inflammation. In non-glial cells (presumed neural cells), we observed a 50-fold increased expression of KCTD12 in prediabetic mice, but a 0.7-fold decrease of KCTD16 in old mice. Glial cell expression of all KCTDs studied increased in old mice, but decreased 0.6-fold for KCTD16 in prediabetic mice. From these results, we infer that proximal small intestine GABABR signalling is disrupted in prediabetes independent of age, with a possible involvement of decreased KCTD16-expressing enteric glia, and highlight KCTD12 and KCTD16 as potential pharmacological targets to study prediabetes prevention.Mollet, Inês Maria de Stoop Camões Teixeira GuerraCarvalho, Margarida Henriques da Gama, 1972-Repositório da Universidade de LisboaMira, Miguel Ângelo de Freitas2023-10-31T01:30:50Z202120212021-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/51325TID:202933865enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:55:56Zoai:repositorio.ul.pt:10451/51325Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T22:02:37.690335Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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