Building novel bioaugmentation consortia for degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons: from selection to metabolic and genetic characterization of adaptive evolved microbial strains

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Nogueira, Ana Raquel Lodeiro
Data de Publicação: 2018
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/36353
Resumo: Tese de mestrado em Microbiologia Aplicada, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, em 2018
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spelling Building novel bioaugmentation consortia for degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons: from selection to metabolic and genetic characterization of adaptive evolved microbial strainsBioremediaçãoBioaumentaçãoMetabolismoHidrocarbonetos aromáticos policíclicosConsórcioTeses de mestrado - 2018Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências BiológicasTese de mestrado em Microbiologia Aplicada, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, em 2018Os hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAP) são poluentes ambientais encontrados na água, no solo e na atmosfera. Estes compostos são de elevada importância devido ao perigo que representam em termos de saúde humana e em termos ambientais, existindo uma lista de 16 HAP considerados poluentes prioritários, apresentando propriedades tóxicas, mutagénicas e/ou carcinogénicas. Por um lado, podem ser gerados naturalmente através de fogos florestais, atividade vulcânica e derramamentos de petróleo. Por outro lado, podem ter origem em atividades antropogénicas durante a combustão incompleta de materiais orgânicos, como o óleo, o petróleo ou a madeira. O facto de serem insolúveis em água dificulta a sua remoção e consequentemente leva a que se tornem recalcitrantes no meio ambiente, persistindo por muitos anos. Várias tecnologias de remediação têm sido testadas com o objetivo de remover estes contaminantes ambientais. Muitas das abordagens têm uma natureza química, o que além de se traduzir em elevados custos económicos também está associado à geração de subprodutos também de natureza tóxica. Recentemente, a biorremediação têm sido alvo de atenção já que o uso de microrganismos para remoção de HAP tem sido vista como uma opção mais segura e com menos custos. Vários géneros de bactérias Gram positivas e Gram negativas, bem como fungos e algas capazes de utilizar estes compostos como fonte de carbono e energia têm sido isolados e caraterizados. Na natureza, são raras as vezes que estes microrganismos com capacidade de degradar poluentes se encontram individualmente. Geralmente, existem em consórcio, ou seja, associações naturais de vários microrganismos diferentes que interagem sinergicamente entre si, aumentando a eficiência de degradação. Esta cooperação resulta por exemplo em interações onde os produtos metabólicos de um microrganismo podem ser o substrato para outro microrganismo. Nas estações de tratamento de águas residuais, o objetivo é obter um efluente que possa retornar ao ciclo da água com o mínimo impacto no ambiente. Neste contexto ecológico, os microrganismos geralmente realizam metabolismo aeróbio, tendo o oxigénio como aceitador final de eletrões. Catabolicamente, as enzimas com atividade de dioxigenase têm um papel fundamental na ativação do HAP para degradação. Um aspeto do metabolismo aeróbio é a formação de intermediários metabólicos como o salicilato, o catecol, o gentisato e o ftalato que após reações enzimáticas originaram metabolitos que compõem o ciclo dos ácidos tricarboxílicos. Estas proteínas com atividade catalítica estão amplamente distribuídas por diferentes microrganismos, considerando-se mesmo a existência de diferentes famílias de enzimas associadas a determinados taxa microbianos. Além disso, verifica-se uma plasticidade metabólica no que diz respeito à degradação destes compostos podendo ocorrer também degradação em condições de anaerobiose, tendo compostos inorgânicos como o sulfato, o nitrato e o ferro como aceitadores de eletrões. No entanto, ainda existe muito por revelar sobre este metabolismo. O presente trabalho tem como objetivo a seleção e caracterização metabólica e genética das melhores estirpes degradadoras presentes na coleção Biotask Bioremediation Culture, com vista à construção de um consórcio para degradação de HAPs, nomeadamente naftaleno, antraceno e fenantreno. Quarenta e sete estirpes microbianas provenientes de quatro experiências de evolução adaptativa e de vários ciclos dessas mesmas experiências tendo antraceno, fenantreno, óleo mineral e tristearina como única fonte de carbono e energia foram estudados. O inóculo inicial das experiências de evolução adaptativa foi proveniente de uma estação de tratamento de águas residuais. Após sete dias de crescimento das quarenta e sete estirpes tendo naftaleno, antraceno e fenantreno como única fonte de carbono e energia, foi realizada uma triagem das quarenta e sete estirpes através de uma avaliação direta e uma avaliação indireta da eficiência de degradação. Diretamente, foi desenvolvido e otimizado um método de quantificação por cromatografia líquida de elevada performance. Através da construção das curvas de calibração para naftaleno, antraceno e fenantreno foi possível dosear a quantidade desses poluentes presentes em amostras biológicas provenientes do crescimento. Indiretamente, foram realizados ensaios que permitiram concluir sobre a viabilidade celular através do método dos números mais prováveis dos microrganismos em estudo após os sete dias de crescimento. Desta triagem inicial, foi possível concluir que os melhores resultados foram obtidos para as estirpes provenientes do ciclo de evolução adaptativa mais recente, ou seja, foi corroborado o sucesso das experiências de evolução adaptativa. Surgiram também evidências da volatilidade e da toxicidade do naftaleno ser um fator que justifica a sua baixa concentração quantificada cromatograficamente e a baixa viabilidade dos microrganismos na presença deste HAP. Com vista a selecionar as estirpes com maior potencial degradativo foi realizada uma análise multivariada que integra os dados quantitativos da cromatografia líquida de elevada performance e os dados de viabilidade celular resultantes dos números mais prováveis. A análise em componentes principais permitiu escolher as estirpes que melhor se posicionavam no espaço formado pelas novas variáveis – componentes principais. Também esta análise permitiu observar que as estirpes pertencentes aos ciclos de evolução adaptativa mais recentes e que se esperam exibirem um melhor comportamento degradativo estavam localizadas na zona do gráfico onde seria expectável encontrar os melhores degradadores. Além das três estirpes selecionadas pela análise de componentes principais, num ensaio de crescimento surgiu um novo microrganismo como contaminante ambiental que foi adicionado à coleção já que exibia um comportamento degradativo em relação aos HAPs e dada a dificuldade em encontrar ao acaso microrganismos com essas caraterísticas (geralmente são isolados em locais já contaminados pelos poluentes), pensou-se ser interessante explorá-lo melhor e incluí-lo nos estudos futuros. Em seguida, os quatro microrganismos selecionados foram identificados presuntivamente através de sequenciação do gene bacteriano que codifica para o RNA ribossomal 16S como pertencentes aos géneros Pseudomonas (dois microrganismos), Acinetobacter e Paraburkholderia. Com o propósito de investigar o metabolismo degradativo dos HAPs por parte destas bactérias, foram realizados estudos de caraterização metabólica e genética. Em primeiro lugar, foi monitorizado durante quinze dias o crescimento destes microrganismos tendo naftaleno, antraceno ou fenantreno como única fonte de carbono e energia. As estirpes foram estudadas isoladamente e em conjunto, constituindo um consórcio bacteriano. Observou-se aparentemente um crescimento bifásico e a estirpe pertencente ao género Pseudomonas destacou-se, apresentando o melhor comportamento degradativo. O consórcio também revelou que as estirpes em conjunto apresentam resultados superiores do que se estiverem a crescer individualmente. Em segundo lugar, foi avaliada a produção de biosurfactantes como estratégia de solubilização destes compostos poluentes. Após uma pré-seleção com um teste qualitativo onde se observou a formação de uma emulsão estável em duas estirpes, foi realizado um ensaio quantitativo através da medição da tensão superficial. Foi possível concluir que a estirpe pertence ao género Acinetobacter aparentemente sintetiza algum composto com atividade surfactante. Em terceiro lugar, foi realizada uma pesquisa de genes que estão reportados como associados ao catabolismo dos PAHs através de polimerase chain reaction (PCR), tendo como alvo enzimas chave para o clivagem de intermediários metabólicos. Além disso, foi também monitorizado o crescimento tendo ftalato como única fonte de carbono e energia. Foi encontrada evidência que a estirpe pertencente ao género Acinetobacter possui genes que lhe permitem optar por um metabolismo aeróbio com clivagem orto do metabolito intermediário catecol. Quanto às estirpes pertences ao género Pseudomonas e ao género Paraburkholderia foi observada a presença de genes que lhe permitem seguir a via de degradação meta do catecol e ainda a via do gentisato. Em adição, a estirpe pertencente ao género Paraburkolderia revelou ser a única que claramente é capaz de crescer tendo ftalato como única fonte de carbono, o que indica que pode também seguir esta via degradativa. Relativamente ao outro microrganismo pertencente também ao género Pseudomonas não foi detetada nenhuma amplificação nem crescimento em ftalato. Em suma, pode concluir-se que o objetivo do trabalho foi atingido, tendo sido selecionadas e estudadas em termos metabólicos e genéticos as estirpes mais promissoras em termos de potencial de degradação de HAPs. Foi verificado o sucesso do crescimento das estirpes no consórcio e relevadas algumas características que podem explicar o seu comportamento degradativo. Mais estudos serão necessários para elucidar mais claramente quais as vias metabólicas do catabolismo destes compostos e consequentemente ter acesso ao máximo do seu potencial de degradação, com vista à construção de um consórcio eficaz para a biorremediação de locais contaminados.Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) are recalcitrant compounds considered as priority pollutants in soil, water and the atmosphere. They can have natural origin (fires, volcanic eruptions, among others) or anthropogenic origin by the incomplete combustion of organic matter (coal, oil, wood). This is not only an environmental problem but also impacts on public health, since studies that indicate the toxicity and mutagenic/carcinogenic effects of PAHs are reported. Many attempts have been made to develop strategies to eliminate these compounds. Bioremediation has emerged as a possible solution to the problem using microorganisms and taking advantage of their degrading capacity to reduce or eliminate the presence of PAHs. The presence of PAHs on planet Earth through the evolution of life shaped the evolution of metabolic pathways allowing microorganisms to use these compounds as carbon and energy sources. A screening of forty-seven strains (Biotask Bioremediation Culture collection) from adaptive evolution experiments was performed. The initial inoculum of the experiments was from a wastewater treatment plant. In order to evaluate the degradative potential of these strains, growth assays were performed with naphthalene, anthracene and phenanthrene as the only source of carbon and energy. Directly, an HPLC method was developed and optimized that allowed the quantification of PAHs present in the biological samples. Indirectly, a cell viability study was performed through the most probable numbers. The most recent cycle of adaptive evolution revealed the best results as expected. The selection of the best degraders was performed through a principal component analysis. In addition, an environmental contaminant revealed an interesting degradative behaviour and was included in the BBC collection. Sequencing of the bacterial 16S rRNA gene, allowed the four strains to be presumptively identified as belonging to the genus Pseudomonas, Acinetobacter and Paraburkholderia. Characterization of the strains involved three phases. Initially, the growth of the microorganisms was monitored having the PAHs as the carbon source for 15 days, both individually and in a consortium. The strain belonging to the genus Pseudomonas present the best results and possibly a bi-phasic growth. The consortium also revealed that strains together yield better results than individual growth. Then, the production of biosurfactants was evaluated qualitatively through the observation of an emulsion and quantitatively through the measurement of surface tension. The strain belonging to the genus Acinetobacter was the only one that apparently synthesizes a compound with surfactant activity. Finally, the presence of genes associated with PAH catabolism and growth having the metabolic intermediate phthalate as the sole source of carbon was evaluated. The strains belonging to the genera Pseudomonas and Paraburkholderia were the ones that presented greater metabolic plasticity. In summary, it can be concluded that the objective of the work was achieved, and the most promising strains with higher potential for degradation of PAHs were selected and studied in metabolic and genetic terms. The growth of the strains in the consortium was successfully achieved and some characteristics that may explain strains degradative behaviour were revealed. More studies will be needed to elucidate more clearly the whole process in order to build an effective consortium for the bioremediation of contaminated sites.Tenreiro, Rogério Paulo de Andrade,1955-Cordeiro, Carlos,1966-Repositório da Universidade de LisboaNogueira, Ana Raquel Lodeiro2019-01-10T18:57:51Z201820182018-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/36353TID:202190854enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:32:58Zoai:repositorio.ul.pt:10451/36353Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:50:38.101115Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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