Unveil the role of actin on KRAS induced autophagy in colorectal cancer, using Caenorhabditis elegans as an “in vivo” model

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Mendes, Adriana Manuela da Silva
Data de Publicação: 2018
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/1822/64584
Resumo: Dissertação de mestrado em Genética Molecular
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spelling Unveil the role of actin on KRAS induced autophagy in colorectal cancer, using Caenorhabditis elegans as an “in vivo” modelPapel da actina na indução de autofagia pelo KRAS no cancro colorretal, usando Caenorhabditis elegans como modelo in vivoColorectal cancerKRASC. elegansLET-60(G13E) mutationAutophagyActomyosin regulatorsCancro colorectalMutação LET-60(G13E)AutofagiaReguladores de actina e miosinaCiências Naturais::Ciências BiológicasDissertação de mestrado em Genética MolecularKRAS is a small GTPase protein that is found mutated in 30-50 % of sporadic colorectal cancer (CRC). It has been showed by us and others that KRAS activating mutations (KRAS G12D, G12V, G13D) upregulate autophagy in CRC cells and lead to an increase in the levels of activated Rho and Rac, two key regulators of actin dynamics, which may play a role in inducing autophagy. The RAS signalling pathway has been primarily dissected in the C. elegans vulva. Indeed, LET-60 (RAS homologue) is required for vulva development, which involves tightly controlled cell proliferation and differentiation. When a LET-60(G13E) mutation is expressed in C. elegans, a multivulva phenotype is originated, indicative of sustained proliferative signaling. Because of the simplicity of the model and available tools, C. elegans vulva development is a unique model to understand the mechanisms underlying the interplay between actin dynamics, RAS and autophagy. Here, we wanted to understand the role of actin dynamics in the induction of autophagy by KRAS proteins. To explore this hypothesis we used C. elegans as an “in vivo” model organism as well as normal colon cells transfected with KRASG13D activating mutation which is the mutation that induces higher levels of autophagy. Consistent with previous studies, we found that LET-60 depletion prevents vulva formation, and that depletion of EPG-5, an autophagy protein, or several actin regulators also led to a vulvaless phenotype. We also show that worms whose only source of LET-60 is the version carrying the gain of function mutation G13E present more than one vulva and increased autophagy in the vulva. Additionally, we shown that LET-60, ANI-1, ARX-2, CYK-1, CDC-42, MLC-4 and UNC-60 are required for autophagy. Furthermore, depletion of those actin proteins in worms expressing LET-60(G13E) decreased the autophagy levels to different extents. Our preliminary results in normal colon cells transfected with KRAS mutation suggested that cells overexpressing KRASWT or KRASG13D mutation have similar F-actin levels/localization pattern in normal conditions that did not change upon autophagy induction. To our knowledge, this is the first time that a correlation between LET-60, actomyosin regulators, autophagy and vulva development is shown in C. elegans. Our results suggest that RAS-induced autophagy could be driven by actomyosin regulators and that autophagy can be involved in the normal development of a tissue. This study provides therefore new insights and opens new perspectives for further investigation in C. elegans and human cells.KRAS é uma proteína com função de GTPase que se encontra mutada em 30 a 50 % dos casos esporádicos de cancro colorectal. O nosso grupo e outros demonstraram que mutações que levam à ativação constitutiva do KRAS (G12D, G12V, G13D), regulam positivamente a autofagia em células de cancro colorectal e aumentam os níveis ativados de Rho e RAC, duas proteínas envolvidas na regulação da dinâmica da actina que possivelmente regulam a indução de autofagia. As vias de sinalização das proteínas RAS foram inicialmente descobertas através do estudo do desenvolvimento da vulva em C. elegans. LET-60, a proteína homóloga ao RAS, é necessária para a formação da vulva que envolve proliferação e diferenciação. Quando uma mutação que induz um ganho de função do let-60 é expressa, mais do que uma vulva é formada, indicativo de proliferação desregulada. Devido à simplicidade do modelo e à disponibilidade de metodologias, o desenvolvimento da vulva em C. elegans é um modelo único para compreender as interações entre RAS, autofagia e dinâmica da actina. Desse modo, pretendemos através deste estudo compreender se actina poderá estar implicada na indução da autofagia pelas proteínas RAS. Para explorar essa hipótese, usamos C. elegans como modelo in vivo assim como células normais de cólon transfectadas com mutações na proteína KRAS. Consistente com estudos anteriores, os nossos dados demonstraram que a depleção de LET-60 previne a formação da vulva e a depleção de EPG-5 que é uma proteína da autofagia ou alguns reguladores de actina levaram à ausência de vulva. Para além disso, nematodes que expressam uma mutação ativadora da proteína LET-60 desenvolveram mais do que uma vulva e apresentaram autofagia aumentada nas vulvas. Mais ainda, os nossos resultados demonstraram que LET-60, ANI-1, ARX-2, CYK-1, CDC-42, MLC-4 e UNC-60 são necessários para induzir autofagia. Análises preliminares em células normais de cólon transfectadas com mutações no KRAS demonstraram que células expressando uma cópia normal de KRAS ou uma cópia de KRAS com a mutação G13D têm níveis similares de actina filamentosa em condições normais ou depois de induzir autofagia. Concluindo, o nosso trabalho estabeleceu pela primeira vez uma correlação entre LET-60, proteínas de actina e autofagia durante o desenvolvimento da vulva. Apesar dos resultados serem preliminares, o nosso trabalho sugere que pelo menos em C. elegans é possível que proteins de actina estejam envolvidas na indução de autofagia pelas proteínas RAS. Contudo, estudos mais detalhados serão necessários quer em C. elegans como no modelo de células de colon.Strategic programme UID/BIA/04050/2013 (POCI-01-0145-FEDER-007569) funded by national funds through the FCT I.P. and by the European Regional Development Fund (ERDF) through the COMPETE2020 - Programa Operacional Competitividade e Internacionalização (POCI);EcoAgriFood NORTE-01-0145-FEDER-00009, supported by Norte Portugal Regional Operational Programme (NORTE 2020), under the PORTUGAL 2020 Partnership Agreement, through the European Regional Development Fund (ERDF);KoDiscovery,Baltimore Maryland, United States USA within the project:"3BP “Anticancer effect of 3-bromopyruvate (3BP) in animal models systems of leucemia- acronym 3BP;European Research Council under the European Union’s Horizon 2020 research and innovation programme to Ana Xavier Carvalho (grant agreement 640553 -ACTOMYO).Preto, AnaCarvalho, Ana Costa Xavier deUniversidade do MinhoMendes, Adriana Manuela da Silva20182018-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttps://hdl.handle.net/1822/64584eng202382818info:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-07-21T12:53:29Zoai:repositorium.sdum.uminho.pt:1822/64584Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T19:52:52.439697Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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