O papel dos cílios na resposta a níveis elevados de glucose

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Marques, Rita Simões
Data de Publicação: 2023
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10400.21/16441
Resumo: O Centro de Química Estrutural é uma Unidade de Investigação financiada pela FCT através dos projetos UIDB/00100/2020 e UIDP/00100/2020. O Institute of Molecular Sciences é um Laboratório Associado financiado pela FCT através do projeto LA/P/0056/2020. Este trabalho foi financiado pelo Instituto Politécnico de Lisboa IPL/2021/ObeCil_ESTeSL e IPL/2022/WintCilGlu_ESTeSL.
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spelling O papel dos cílios na resposta a níveis elevados de glucoseGlucoseCílioCiliopatiaYAPALMS1CiliaCiliopathyIPL/2021/ObeCil_ESTeSLIPL/2022/WintCilGlu_ESTeSLO Centro de Química Estrutural é uma Unidade de Investigação financiada pela FCT através dos projetos UIDB/00100/2020 e UIDP/00100/2020. O Institute of Molecular Sciences é um Laboratório Associado financiado pela FCT através do projeto LA/P/0056/2020. Este trabalho foi financiado pelo Instituto Politécnico de Lisboa IPL/2021/ObeCil_ESTeSL e IPL/2022/WintCilGlu_ESTeSL.Mestrado em Tecnologias Moleculares em SaúdeAs células eucariotas têm a capacidade de montar cílios primários na sua superfície, os quais são críticos para a sinalização e homeostasia celular. Disfunções ciliares estão na base do desenvolvimento de um conjunto de doenças designadas por ciliopatias. Recentemente, foi identificada uma nova variante no gene ALMS1 numa população de indivíduos obesos caracterizada por uma mutação de substituição c.5552C>T. O gene ALMS1 codifica para uma proteína que se localiza no centrossoma e no corpo basal, sendo importante para a montagem dos cílios. Mutações neste gene têm sido frequentemente associadas ao desenvolvimento da Síndrome de Alström, uma ciliopatia. Foram objetivos deste trabalho avaliar o papel dos cílios na resposta a níveis elevados de glucose em células hTERT-RPE-1. Foi também nosso objetivo avaliar se a via de sinalização Hippo, que está associada a cílios primários, seria afetada. Para isso, estudámos o impacto nos níveis celulares de um dos membros desta via, a proteína reguladora YAP. Pretendemos ainda avaliar como a variante do gene ALMS1 c.5552C>T influencia a montagem e função dos cílios, estabelecendo uma relação com o metabolismo da glucose e com os níveis e localização do YAP na célula. Para alcançar os nossos objetivos montámos um setup no qual as células hTERT-RPE-1 foram expostas a diferentes concentrações de glucose (5 mM, 25 mM, e 5 mM glucose+ 20 mM de manitol). A exposição à glucose ocorreu após a indução da montagem de cílios primários por remoção de soro, ou alternativamente, a montagem destas estruturas foi induzida após a exposição à glucose. Observámos que a presença de cílio primário, antes da suplementação com glucose, tem um impacto na regulação dos níveis da YAP, apresentando uma menor tendência para as células progredirem no ciclo celular como analisado por fluxocitometria. Adicionalmente, sabendo que a variante de histona γ-H2AX é um marcador de danos na molécula de DNA e de senescência celular, e que os níveis de YAP estão associados à regulação da senescência, estudámos a localização e a intensidade da marcação por imunofluorescência da γ-H2AX no setup acima descrito. Observámos que a presença dos cílios primários antes da exposição à glucose parece aproximar a expressão da γ-H2AX ao observado nas células controlo, mas também diminuir o tamanho e a granularidade celular. Resultados preliminares obtidos com um mutante de ALMS1 que gera uma proteína truncada criado por CRISPR/Cas 9 revelaram a ausência de microtúbulos acetilados, o que poderá ter impacto na ciliogénese. Este trabalho suporta a ideia de que o cílio primário funciona como um importante regulador da homeostasia em resposta a níveis elevados de glucose em células hTERT-RPE-1. Mostra ainda, que a truncagem da proteína ALMS1 pode condicionar a acetilação de microtúbulos, uma observação até aqui desconhecida.ABSTRACT - Eukaryote cells have the ability to assemble primary cilia on their surface, which is critical for cell signaling and homeostasis. Ciliary dysfunctions are the basis for the development of a set of diseases collectively designated by ciliopathies. Recently, a new variant in the ALMS1 gene characterized by a substitution mutation c.5552C>T was identified in a population of obese individuals. The ALMS1 gene encodes a protein that localizes at the centrosome and basal body, which is important for the assembly of cilia. Mutations in this gene have often been associated with the development of Alström Syndrome, a ciliopathy. The main objectives of this work were to evaluate the role of primary cilia in the response to high glucose levels in hTERT-RPE-1 cells. It was also our objective to evaluate whether the Hippo signaling pathway, which is associated with primary cilia, would be affected, studying for this, the impact on the levels of one of the members of this pathway, the regulator YAP. We also assessed how the ALMS1 c.5552C>T gene variant influences the assembly and function of the cilia, establishing a relationship with glucose metabolism and with the levels and localization of YAP in the cell. To achieve our objectives, we established a setup in which hTERT-RPE-1 cells were exposed to different glucose concentrations (5 mM, 25 mM, and 5 mM glucose+ 20 mM of mannitol). Exposure to glucose occurred after induction of the assembly of primary cilia by removal of serum from the culture medium, or alternatively, the assembly of these structures was induced after exposure to glucose. We observed that the assembly of primary cilia before glucose supplementation has an impact on the regulation of YAP levels, with a lower tendency for cells to progress in the cell cycle as analyzed by flow cytometry. On the other hand, knowing that the histone variant γ-H2AX is a marker of DNA damage and cellular senescence and that YAP levels are associated with senescence regulation, we studied the location of γ-H2AX in the above-described setup. We observed that the presence of the primary cilia, before exposure to glucose, seems to approximate the expression of γ-H2AX to that observed in control cells, as well as a decrease in cell size and granularity. Preliminary results obtained with an ALMS1 mutant created by CRISPR/Cas 9 that generates a truncated protein revealed that these cells lost the ability to acetylate microtubules, which may have an impact on ciliogenesis. This work supports the idea that the primary cilia are an important regulator of homeostasis in response to high glucose levels in hTERT-RPE-1 cells. It also shows that the truncation of the ALMS1 protein may dramatically affect the acetylation of microtubules, a previously unknown observation.Instituto Politécnico de Lisboa, Escola Superior de Tecnologia da Saúde de LisboaCarmona, BrunoSoares, HelenaRCIPLMarques, Rita Simões2023-052023-05-01T00:00:00Z2024-08-31T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10400.21/16441TID:203309634porMarques RS. O papel dos cílios na resposta a níveis elevados de glucose [dissertation]. Lisboa: Escola Superior de Tecnologia da Saúde de Lisboa/Instituto Politécnico de Lisboa; 2023.info:eu-repo/semantics/embargoedAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-09-06T02:15:58Zoai:repositorio.ipl.pt:10400.21/16441Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T20:28:20.280504Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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