Serum miRNA profiling for the early-diagnosis of distal cholangiocarcinoma
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| Data de Publicação: | 2020 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | eng |
| Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10451/58223 |
Resumo: | Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, 2021, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia. |
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Serum miRNA profiling for the early-diagnosis of distal cholangiocarcinomaBiomarkersDistal cholangiocarcinomaSerum miRNA profilingmiR-95miR-154miR-204miR-200cTeses de mestrado - 2021Ciências da SaúdeTese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, 2021, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.O colangiocarcinoma distal (dCCA) é um tumor maligno que resulta de uma associação entre mutações genéticas e fatores ambientais. A inexistência de sintomas específicos, associada à sua localização anatómica ser a mesma - ou muito próxima - para outras doenças como o adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) ou doenças pancreáticas benignas (BPD), são fatores responsáveis pelo diagnóstico tardio desta doença. Por esta razão, as opções de tratamento disponíveis na altura do diagnóstico são muito limitadas e pouco eficazes, conduzindo a uma baixa taxa de sobrevivência. O local de formação do dCCA é também um obstáculo para o uso de técnicas de imagiologia como forma de obter um diagnostico preciso, o que faz com que biópsias invasivas sejam necessárias para confirmar a presença da doença. O uso de biomarcadores não invasivos, presentes em fluídos corporais, aparenta ser uma opção mais viável para obter um diagnóstico precoce do dCCA. No entanto, apesar dos avanços e estudos realizados nesta área de investigação, não há ainda biomarcadores não invasivos com eficácia suficiente para o diagnostico precoce desta doença. O uso de microRNAs como potenciais biomarcadores tem vindo a despertar interesse na comunidade médica e científica, visto que perturbações na homeostase de diversos miRNAs tem sido correlacionada com a presença de certos tipos de tumores, como é o caso do dCCA e PDAC. Adicionalmente, os microRNAs do soro apresentam diversas características que os tornam potenciais candidatos a biomarcadores eficientes: apresentam um elevada biodisponibilidade e estabilidade em fluídos corporais; estão envolvidos na regulação de diversas vias de sinalização em todos os órgãos do corpo humano; e são de fácil acessibilidade quando presentes na circulação sanguínea. Desta forma, neste trabalho procurámos determinar padrões de expressão de microRNAs presentes no soro de doentes com dCCA, PDAC e BPDs, com o objetivo de encontrar potenciais biomarcadores para o diagnóstico precoce e diferencial entre as doenças em estudo. Em primeiro lugar, foram obtidas amostras de soro de doentes com confirmação histológica de dCCA (n=35), PDAC (n=38), cisto pancreático (n=22), pancreatite crónica (n=20), e também de indivíduos saudáveis (n=45), juntamente com uma descrição clínica detalhada para cada indivíduo. Os microRNAs no soro foram isolados através do kit de extração miRNeasy Serum Advanced Kit e, posteriormente, os níveis de 188 microRNAs humanos no soro foram determinados para uma pool de amostras correspondentes a cada um dos grupos em estudo: controlo, dCCA, PDAC, cisto pancreático (BPD cysts) e pancreatite crónica (BPD pancreatitis). Os níveis de expressão dos 188 miRNAs para cada amostra representativa foram determinados usando TaqMan™ Advanced miRNA Human Serum array cards. Posteriormente, os microRNAs com mais potencial como biomarcadores foram escolhidos seguindo critérios de seleção previamente definidos. Após este passo, a expressão dos microRNAs selecionados foi determinada para cerca de metade das amostras envolvidas no estudo, recorrendo-se a ensaios de Taqman Advanced Real-Time RT-PCR com o objetivo de filtrar e resselecionar os microRNAs com maior potencial para uma posterior análise em todas as amostras/indivíduos. Em seguida, os padrões de expressão dos microRNAs resselecionados foram novamente determinados, desta vez para todos os indivíduos envolvidos no estudo, e os resultados obtidos foram correlacionados com os dados clínicos dos doentes. Por último, a performance de diagnóstico dos miRNAs selecionados, tendo em conta os repetitivos critérios de seleção, foi testada através da elaboração de curvas características de operação do recetor (ROC) de forma a extrapolar os respetivos valores de sensibilidade e especificidade para o diagnóstico. Os resultados obtidos através do RT-PCR em tempo real para as amostras representativas de cada grupo revelaram diferentes padrões de expressão dos miRNAs no soro entre os diferentes grupos em estudo. Após validação dos resultados obtidos para as amostras representativas, foram selecionados quatro microRNAs com maior potencial como biomarcadores. Em doentes com dCCA, os níveis de miR-95-3p e miR-154-5p em circulação estavam aumentados e diminuídos, respetivamente, comparando com doentes com PDAC e também com doentes com cistos pancreáticos, pancreatite crónica, ou indivíduos saudáveis. Já o miR-200c-3p e o miR-204-5p apresentaram níveis em circulação elevados em indivíduos com pancreatite crónica e indivíduos com cistos pancreáticos, respetivamente, quando comparados com todos os restantes grupos em estudo. Adicionalmente, os níveis de expressão de todos os microRNAs mencionados parecem ser independentes do sexo dos indivíduos e também da presença ou não de fatores de risco relacionados com doenças hepáticas (previamente identificadas). No entanto, os níveis de miR-95-3p e miR-154-5p correlacionam-se com presença de diabetes em certos indivíduos. Curiosamente, os níveis de expressão do miR-95-3p revelaram uma correlação positiva com a idade dos indivíduos com PDAC e, também, com os níveis de CA 19-9 no soro de doentes com dCCA, o biomarcador do soro mais reconhecido e utilizado no diagnostico de dCCA e PDAC. O miR-95-3p permitiu ainda a obtenção de um diagnóstico diferencial entre dCCA e PDAC com uma especificidade de 97.06%. Já os níveis de expressão do miR-154-5p mostraram uma correlação negativa com os níveis de GGT no soro e permitiram um diagnóstico diferencial entre dCCA e PDAC com uma sensibilidade de 72.41% e especificidade de 66.67%, suplantando a performance do CA 19-9 para o mesmo grupo experimental. Por último, tanto os níveis circulantes do miR-200c-3p como do miR-204-5p revelaram uma correlação positiva com a idade dos indivíduos em estudo. Foi também encontrada uma correlação negativa entre os níveis circulantes do miR-200c-3p com o BMI e com os níveis de GGT. Finalmente, o miR-204-5p revelou uma sensibilidade de 94.74% no diagnostico diferencial entre indivíduos com cistos pancreáticos em relação aos grupos com pancreatite aguda e dCCA. Concluindo, e de uma forma geral, os padrões de expressão dos miRNAs séricos selecionados parecem ser úteis para a obtenção de um diagnóstico diferencial entre indivíduos com dCCA e indivíduos com PDAC, assim como a sua diferenciação em relação a indivíduos com as doenças benignas pancreatite crónica e cistos pancreáticos. O facto do miR-154-5p ter revelado uma performance de diagnóstico ligeiramente superior ao CA 19-9, comparando o grupo dCCA com o grupo PDAC, sugere que uso de miRNAs como ferramentas de diagnóstico nestas doenças tem um elevado potencial, realçando a importância da realização de estudos futuros como o mesmo objetivo. Para além disso, os níveis de expressão dos quatro miRNAs correlacionaram-se com diversas características clínicas dos indivíduos em estudo, sugerindo que poderão estar ainda envolvidos nos mecanismos de patogénese e progressão destas patologias. Neste âmbito, e de uma forma geral, os resultados obtidos indicam que os miRNAs miR-200c-3p, miR-154-5p e miR-204-5p parecem atuar como supressores de tumores. Já o miRNA miR-95-3p aparenta ser um oncomiR, promovendo a inibição ou degradação de RNAs mensageiros (mRNAs) correspondentes a genes supressores de tumores. No entanto, o mecanismo patogénico por detrás da ação destes miRNAs está longe de estar bem descrito, principalmente no caso do dCCA. Assim, seria importante estudar quais os mecanismos e funções regulatórias destes quatro microRNAs, que de alguma forma poderão contribuir para o desenvolvimento e progressão destas doenças hepatopancreaticobiliares. Futuros estudos de validação de resultados, independentes, irão com certeza contribuir para o uso clínico de miRNAs do soro como biomarcadores eficientes no diagnostico precoce do colangiocarcinoma distal, e o investimento em estudos envolvendo painéis de microRNAs como biomarcadores através de uma análise combinada parece ser o caminho certo a seguir para atingir esse objetivo.Distal cholangiocarcinoma (dCCA) is an aggressive malignancy originating from an interplay between genetic mutations and environmental factors. The lack of significant symptoms and the close anatomical location to other diseases, such as pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) or benign pancreatic diseases (BPDs) are some of the factors responsible for the late diagnosis of this disease, thus limiting therapeutic options and aggravating prognosis. The anatomical location of dCCA challenges the use of medical imaging modalities, for which biopsy is still mandatory to confirm diagnosis in clinical practice. The use of non-invasive biomarkers present in body fluid could represent a better option for an earliest diagnosis of dCCA. In this regard, we aimed to profile global serum miRNA expression changes in human patients with dCCA, PDAC and BPDs, in order to identify potential candidates for the differential diagnosis of these diseases. Serum samples were obtained from patients with histopathologic confirmation of dCCA (n=35), PDAC (n=38), BPD patients with cysts (n=22), BPD patients with chronic pancreatitis (n=20), and from healthy subjects (n=45), with a detailed biochemical and clinical characterization. Serum miRNAs were isolated using the miRNeasy Serum Advanced Kit and, subsequently, 188 unique human serum miRNAs were globally profiled in randomly selected pooled samples for each experiment group, using TaqMan™ Advanced miRNA Human Serum array cards. Specific selection criteria were applied in order to select the miRNAs with the most potential as biomarkers. After this step, expression of the selected miRNAs was determined by Taqman Advanced Real-Time RT-PCR for half the samples included in the study to funnel the number of potential miRNA biomarkers to be analysed in the whole cohort of patients. Subsequently, the expression patterns of the re-selected miRNAs were determined for the whole cohort of patients and analysed for correlation with clinical and laboratory data from the patients. Real time RT-PCR array analysis revealed distinct serum miRNA expression profiles between all groups of patients. Upon individual validation, miRNAs found to be mostly differentially expressed in dCCA included miR-95-3p and miR-154-5p, up- and down-regulated, respectively, comparing with PDAC, BPDs and healthy controls. Additionally, miR-200c-3p and miR-204-5p showed increased levels in BPD patients with chronic pancreatitis and cysts, respectively, when compared to all the other groups. Furthermore, circulating levels of the above miRNAs appear to be independent of the patient gender or presence of selected liver-related risk factors, although miR-95-3p and miR-154-5p revealed to be influenced by the presence of diabetes. Interestingly, miR-95-3p expression positively correlated with age in in PDAC patients and with antigen19-9 (CA 19-9), an established tumour biomarker, in dCCA patients, while distinguishing dCCA from PDAC patients with 97.06% specificity. Interestingly, miR-154-5p was also found to be negatively correlated with serum GGT and was capable of distinguishing dCCA from PDAC with 72.4% sensitivity and 66.7% specificity, outperforming CA 19-9 for the same cohort of patients. Last but not least, both miR-200c-3p and miR-204-5p expression positively correlated with patient age. A negative correlation was found between miR200c-3p and BMI, as well as GGT. In turn, miR-204-5p was able to distinguish BPD cysts from controls, BPD pancreatitis and dCCA with 94.74% sensitivity. In conclusion, serum miRNA expression profiles potentially allow for the differential diagnosis of dCCA from both benign and malignant pancreatic diseases, with the 4 selected miRNAs further correlating with key clinical features of patients. Further validation in independent cohorts could translate into the use of miRNAs as accurate biomarkers for dCCA early diagnosis.iMed.ULisboa.Castro, Rui Eduardo MotaRodrigues, Cecília Maria PereiraRepositório da Universidade de LisboaTomás, André Filipe Agostinho2024-01-29T01:31:52Z2021-01-292020-12-182021-01-29T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/58223TID:203207408enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2024-02-05T01:21:50Zoai:repositorio.ul.pt:10451/58223Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T22:08:32.359111Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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