Diagnóstico molecular e análise de polimorfismos do gene S1 de estirpes brasileiras do coronavírus bovino em fezes diarreicas de bezerros naturalmente infectados

• Autor(a) principal: Elisabete Takiuchi
• Data de Publicação: 2006
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UEL
• Texto Completo: http://www.bibliotecadigital.uel.br/document/?code=vtls000119466

O coronavírus bovino (BCoV) é um importante agente etiológico de diarréia neonatal em bezerros. Usualmente, as técnicas para a detecção do BCoV limitam-se a métodos de baixa sensibilidade como ensaios imunoenzimáticos e testes de hemaglutinação (HA)/ inibição da hemaglutinação (HI). Embora a PCR seja altamente sensível e específica, a natureza da amostra biológica é um fator limitante no diagnóstico do BCoV, devido à presença de inibidores de PCR nas fezes que podem gerar resultados falso-negativos. A utilização de um controle interno na reação de PCR tem sido útil para monitorar a qualidade da extração e amplificação do ácido nucléico. Este trabalho teve como objetivo desenvolver um sistema de Semi nested-PCR (SN-PCR) para amplificação de um fragmento de 251 pares de bases (pb) do gene do nucleocapsídeo (N) do BCoV a partir de amostras fecais congeladas (n=25) e frescas (n=25) de bezerros com sinais clínicos de diarréia e naturalmente infectados. Para aperfeiçoar a detecção do BCoV em amostras fecais pela SN-PCR foi avaliada a inclusão de um controle interno e os resultados foram comparados com uma RT-PCR convencional descrita na literatura. O gene N do BCoV foi detectado pela SN-PCR e RT-PCR em respectivamente, 24% (12/50) e 8% (4/50) das amostras analisadas (K=0,43). Somente as amostras que não sofreram o congelamento foram positivas na RT-PCR enquanto a SN-PCR descrita neste trabalho detectou o BCoV em ambas condições de preservação. A possibilidade de resultados falso-negativos foi descartada com a amplificação do controle interno em todas as amostras analisadas. A inclusão de um controle interno na PCR possibilitou maior precisão no diagnóstico do BCoV como agente etiológico da diarréia em bezerros. Com o objetivo de estabelecer as relações genéticas entre as três estirpes brasileiras de BCoV daquelas descritas em outros países, foi desenvolvida uma estratégia de seqüenciamento para o gene que codifica a subunidade S1 da glicoproteína da espícula aplicando posteriormente o método da máxima parcimônia para realização das estimativas filogenéticas. A análise filogenética da seqüência total de nucleotídeos e dos aminoácidos deduzidos do gene S1 revelou que as estirpes brasileiras descritas neste trabalho apresentaram maior identidade com a estirpe entérica americana BCoV-ENT com 98,7% e 98,7%, respectivamente. A menor identidade foi observada com o protótipo BCoV Mebus com 97,8% (nucleotídeos) e 96,8% (aminoácidos). Na reconstrução da árvore filogenética não enraizada, baseada na região hipervariável da subunidade S1, nossas amostras foram agrupadas com as amostras americanas (BCoV-ENT, 182NS), amostras canadenses de diarréia neonatal (BCQ20, BCQ7373, BCQ2070, BCQ9, BCQ571, BCQ1523) e uma amostra canadense de diarréia do inverno (BCQ2590) e agruparam-se em um ramo separado das estirpes de origem coreana e as estirpes respiratórias de BCoV. Observou-se ainda que as três estirpes localizaram-se em um ramo bem distante de outras amostras brasileiras (AY606193, AY606194) anteriormente descritas. Portanto, estes dados colaboram com a reconstrução genealógica dos BCoV e sugerem a existência de no mínimo dois BCoV circulantes no Brasil. Adicionalmente o presente trabalho apresenta a descrição de uma mutação inédita na seqüência de aminoácidos observada no sítio de clivagem da proteína S. As prováveis conseqüências biológicas desta mutação foram especuladas a partir de estudos relacionados com o coronavirus da hepatite dos comundongos (MHV).