Lipossomas ph-sensíveis contendo complexo deciclodextrina catiônica/DNA plasmidial: otimização do método de preparo, caracterização físico-química eestudo de transfecção

• Autor(a) principal: Sonia Maria Lucas da Silva
• Data de Publicação: 2011
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFMG
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/1843/EMCO-8KKJGT
• topic: lipossomas aniônicos pH-sensíveis; fatorial; citotoxicidade; experimento; activina; Terapia gênica; EDXD; EGFP; células LNCaP; Tecnologia farmacêutica; Lipossomos; Câncer Tratamento; Terapia gênica; Transfecção; Farmácia

Dentro do grupo dos vetores não virais, os lipossomas pH-sensíveis constituem uma alternativa interessante para ser utilizada na terapia gênica, pois em pH ácido, como ocorre no interior dos endossomas sofrem transição de fase, que conduz à desestabilização da bicamada lipídica, promovendo, assim, a liberação do material genético encapsulado. Este trabalho apresenta o desenvolvimento e acaracterização físico-química de lipossomas pH-sensíveis, compostos por DOPE:CHEMS (razão molar 6:4, respectivamente), contendo o plasmídeo pAct - capaz de expressar o gene da proteína activina, com propriedade de reduzir o crescimento celular do câncer de próstata. Estes lipossomas denominados LpAct foram produzidos pelo método de evaporação em fase reversa, após prévia complexação do plasmídeo pAct com moléculas da 6-monodesoxi-6-monoamina-- cyclodextrina (Am--CD+), na razão de carga Am--CD+/pAct- igual a +1/-1. Oexperimento fatorial completo 24 foi utilizado para avaliar a influência dos fatores velocidade de rotação, intensidade de vácuo, concentração de lípides e concentração de pAct sobre o teor de encapsulação de pAct nos lipossomas. Este estudo foi conduzido com o intuito de se estabelecer um protocolo de produção de LpAct de uma maneira racional. Dos fatores analisados, a intensidade do vácuo e aconcentração do plasmídeo pAct foram os que mais influenciaram o aumento do teor de encapsulação de pAct nos lipossomas. De acordo com o estudo fatorial, o protocolo de produção de LpAct adotado para a otimização do teor encapsulado de pAct foi: o uso da velocidade de rotação a 120 rpm, da intensidade de vácuo a 300mbar, concentração de lípides de 10 mM e concentração do plasmídeo pAct de 30 g/mL. O teor de pAct encapsulado com este protocolo foi cerca de 85% (25 g/mL). A técnica de difração de raios X dispersiva em energia (EDXD) foi utilizada para investigar a organização supramolecular das moléculas do DOPE em relação àpresença do complexo Am--CD+/pAct, dos componentes do meio de cultura e das proteínas do soro fetal bovino, nos pH 7,4 e 5,0. Em pH fisiológico, o estudo revelou que o complexo Am--CD+/pAct interage com a membrana lípidica dos lipossomas resultando na presença das fases lamelar e hexagonal. Entretanto, em pH 5,0, somente a fase hexagonal foi observada. Nos valores de pH 5,0 e 7,0, a presença dos constituintes do meio de cultura e das proteínas conduziu à formação deestruturas menos ordenadas, no entanto, a pH-sensibilidade do sistema foi preservada. O método MTT foi utilizado para avaliar a citotoxicidade dos LpAct sobre a linhagem de células de câncer de próstata LNCaP. A capacidade de transfecção dos lipossomas nestas células foi investigada mediante a expressão da proteínaverde fluorescente (EGFP). O estudo contemplou a avaliação dos tempos de transfecção de 4, 6, 24 e 48 horas e a presença ou não de soro fetal bovino. De acordo com os resultados os LpAct foram capazes de transfectar as células LNCaP, porém de forma menos eficiente que o agente de transfecção catiônico utilizado como controle (Lipofectamina 2000).