Efeito da deleção do gene que codifica uma proteína de ligação à RNA sobre o transcriptoma de epimastigotas de Trypanosoma cruzi

• Autor(a) principal: Wanessa Moreira Goes
• Data de Publicação: 2018
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFMG
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/1843/35082
• topic: Trypanosoma cruzi; RBP; RNA-seq; 3’ UTR; Biologia computacional; Doença de Chagas; Trypanosoma cruzi; Motivo de reconhecimento de RNA; RNA-Seq; Regiões 3' não traduzidas

Trypanosoma cruzi, o agente etiológico da doença de Chagas é um protozoário que apresenta três formas durante o seu ciclo de vida, as quais são bioquimicamente e morfologicamente distintas e programadas para responder rapidamente às drásticas mudanças ambientais que esse parasita enfrenta em seus vários hospedeiros. Ao contrário de outros eucariotos, os genes que codificam proteínas neste protozoário são transcritos em pré-mRNAs policristônicos, os quais são processados em mRNAs maduros por meio de reações acopladas de "trans-splicing" e de poli-adenilação. Devido a isso, o controle da expressão gênica depende principalmente de mecanismos pós-transcricionais mediados por proteínas de ligação ao RNA (RBPs), que controlam os níveis steady-state e as taxas de tradução dos mRNAs. RNA-seq de epimastigotas, tripomastigotas e amastigotas, juntamente com buscas por motivos característicos de RBPs permitiu a identificação de uma proteína com níveis de expressão aumentados na forma epimastigota, quando comparados às formas amastigotas e tripomastigotas. Essa proteína foi nomeada TcRBP99. Experimentos de metaciclogênese comparando epimastigotas do tipo selvagem (WT) e epimastigotas nas quais o gene que codifica TcRBP99 foi eliminado identificou um papel relacionado à diferenciação do parasito uma vez que um aumento na taxa de metaciclogênese foi observado em parasitas nocautes. Com base nesses dados, o presente trabalho teve como objetivo analisar o efeito da deleção do gene que codifica a TcRBP99, no controle da expressão gênica de formas epimastigotas de T. cruzi, buscando identificar genes cuja expressão estaria associada à metaciclogênese. Foram conduzidas análises de RNA-seq que comparam a expressão gênica de epimastigotas WT e epimastigotas de duas linhagens nocautes para essa RBP. Bibliotecas de cDNA foram sequenciadas na plataforma Illumina MiSeq e em seguida foram conduzidas análises de qualidade das reads geradas. Posteriormente, realizou-se mapeamento das reads contra o genoma completo de CL Brener, por meio da ferramenta TopHat2 e análises de expressão gênica diferencial utilizando os seguintes pacotes: EdgeR, limma e Deseq2. Para a seleção de genes diferencialmente expressos (DGE), foram definidos os parâmetros p-ajustado (padj) < 0,05 e mudança de expressão maior ou menor que 2 vezes. Por fim, regiões 3’ UTR foram determinadas, possibilitando a identificação de motivos, por meio das ferramentas MEME e MAST. Como resultados, obtivemos em média, 3,6 milhões de reads com qualidade baseada no phred score igual ou maior que 20 para cada uma das sete bibliotecas, e mapeamento, em média, de 73,28% dessas reads. Análises de expressão diferencial revelaram 9 genes que apresentaram expressão reduzida em epimastigotas nocautes em comparação com WT: um deles codifica para a proteína associada à diferenciação, cujo mRNA está aumentado em epimastigotas WT comparadas com tripomastigotas e amastigotas. Dois genes da família RHS e um gene que codifica transportador de aminoácidos também tiveram a expressão diminuída na ausência da TcRBP99. Análises de motivos em regiões 3’ UTRs desses mRNAs mostraram que há três motivos conservados, mas que nenhum está presente nas quatro UTRs, ao mesmo tempo. Os resultados obtidos neste trabalho sugerem que a TcRBP99, ao se ligar a mRNAs em formas epimastigotas causa a estabilização desses mRNAs, aumentando assim a expressão de genes responsáveis pela proliferação de epimastigotas, o que consequentemente leva a diminuição da taxa de diferenciação de epimastigotas para tripomastigotas metacíclicas.