Avaliação neuroquímica do sistema colinérgico de camundongos com o gene do transportador vesicular de acetilcolina (VAChT) modificado geneticamente

• Autor(a) principal: Cristina Martins e Silva
• Data de Publicação: 2008
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFMG
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/1843/SMOC-7JAPKY
• topic: Acetilcolina; Neurotransmissão Colinérgica; VachT; camundongos geneticamente modificados; Acetilcolina; Mecanismos colinérgicos; Farmacologia; Neurorreguladores

O transportador vesicular de acetilcolina (VAChT) é responsável por armazenar acetilcolina em vesículas sinápticas, passo importante para a manutenção da transmissão colinérgica. Com o objetivo de estudar o papel do VAChT na manutenção do tônus colinérgico, geramos diferentes linhagens de animais em que esse gene foi alterado através de recombinação homóloga. Uma estratégia para interferir com a expressão do gene do VAChT foi a inserção de um cassete contendo o gene de resistência a neomicina na região 5 não traduzida do VAChT. Esta modificação genética gerou camundongos com diminuição HET HOM e KD da expressão do VAChT (VAChT Knockdown). Os animais KD apresentam redução de aproximadamente 45 e 65% da expressão de VAChT, respectivamente. Observamos acúmulo de acetilcolina não liberada no cérebro dos camundongos KD e isso não parece ser devido a alterações de expressão da choline acetyltransferase ou do transportador de alta afinidade de colina. Ensaios de eletrofisiologia na junção neuromuscular mostraram que existe uma diminuição no HET HOM tamanho do quanta nos camundongos KD e KD sendo a diminuição maior nos HOM HETcamundongos KD que nos KD . Nós também produzimos camundongos em que o gene do VAChT foi Flox/Floxflanqueado por seqüências LoxP (camundongos VAChT ) a fim de utilizá-los para o acasalamento com camundongos que expressam a enzima Cre em diferentes regiões do cérebro. Os camundongos gerados, portanto, poderiam apresentar deleção do gene do VAChT em tecidos espeficos. Nossa caracterização inicial dos camundongos Flox/Flox VAChT mostrou que eles apresentam redução em torno de 50% na expressão do mRNA de VAChT, além de um aumento em torno de 100% na expressão do mRNA da enzima ChAT e um aumento de 6 vezes nos níveis de acetilcolina no cérebro quando WT/WT comparados com os animais VAChT . A amplitude dos potencias miniatura Flox/Flox (MEEPs) de placa motora está aumentada nos camundongos VAChT , sem Flox/Flox alterações na freqüência. Apesar dessas alterações, os camundongos VAChT são fenotipicamente normais. Flox/WT Flox/Flox Camundongos VAChT ou VAChT foram acasalados com camundongos que expressam Cre sob o controle do promotor CAMKII. Os Flox/Flox, cre+ camundongos VAChT gerados são morfologicamente normais ao nascimento, entretanto, após cinco dias de vida tornam-se menos ativos e exibem menor crescimento que os animais controle da mesma ninhada. Além disso, os camundongos Flox/Flox VAChT apresentam fraqueza muscular generalizada, desenvolvimento anormal da coluna espinhal acarretando em cifose e sobrevivem apenas cerca de 8 semanas. Nós também geramos uma linhagem de camundongos com a deleção de um dos alelos do Flox/Del, cre+ VAChT. Os camundongos VAChT, apresentaram os mesmos fenótipos dos Flox/Flox, cre+, Flox/Del, cre+ camundongos VAChT porem os camundongos VAChT sobrevivem apenas cerca de 20 dias. Flox/Flox,cre- Flox/Del, cre- Surpreendentemente, os animais VAChT e VAChT embora não expressem a Cre, apresentam ausência de VAChT em diversas regiões do SNC. Além disso, os níveis teciduais de acetilcolina também estão aumentados em torno de Flox/Del, cre-. doze vezes nos camundongos VAChT Interessantemente, nenhum dos estudos comportamentais e eletrofisiológicos realizados sugerem que o VAChT esteja alterado, já que os animais são fenotipicamente normais. Como os camundongos Flox/Flox,cre- Flox/Del, cre- VAChT e VAChT apresentam mRNA para o VAChT, é possível que exista um mecanismo regulatório da expressão do transportador ainda desconhecido. Nossos resultados confirmam a importância de VAChT na regulação da liberação de acetilcolina e, consequentemente, na manutenção das funções fisiológicas normais do sistema nervoso central e periférico.